Tế bào gốc phôi

Việc phát hiện ra tế bào gốc phôi - không có tai nạn, và xuất hiện trên các nghiên cứu đất chuẩn bị trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phát triển. Thuật ngữ "tế bào gốc" đã được giới thiệu vào y học năm 1908 tại Hội của Quốc hội Huyết học tại Berlin, Alexander Maximov áp dụng cho các tế bào tạo máu. Rất lâu trước khi sự cô lập và chuẩn bị các dòng ổn định của tế bào gốc phôi đa năng trong việc phát triển đầu của quá trình nghiên cứu sử dụng terato- gốc (tế bào phôi-ung thư mà nghiên cứu các cơ chế không rõ của phôi, bao gồm một chuỗi các sự biểu hiện của gen sớm và sản phẩm protein của công việc của họ.

Nhưng sự tò mò của bộ gen con người không thể sửa lại được trong quá trình tiến hóa? Không, và sự phát triển của phôi thai là bằng chứng. Nếu như vậy thì khi về nguyên tắc, con đường phát triển tiến hóa thứ hai sẽ được thực hiện? Có lẽ, khi một người rời Cosmos, nơi mà điều kiện môi trường sẽ tương đối ổn định trong một thời gian khá dài. Mất xương (khử khoáng xương trong tình trạng không trọng lượng) tu sửa rất chậm tuân theo và tái tạo có thể được coi như là bước đầu tiên cho quá trình thích ứng của con người như một loài tồn tại trong không gian. Tuy nhiên, sự chi trả cho con đường phát triển tiến hóa thứ hai sẽ khác nhau - tính vô sinh sẽ là giá để trả lại cho tất cả các tế bào của totipotency và độ dẻo tuyệt đối. Vì vậy, nhân trong thế giới của "tắc kè hoa tiến hóa" sẽ không có meiosis, otpochkovaniem. Nhưng chúng ta sẽ sống lâu. Telomerase bất tử là sự bất tử của amip. Trong một sinh vật đa bào, các tế bào gốc là chất nền của tuổi thọ định lượng và chất lượng.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Nguồn của tế bào gốc phôi

Nguồn Hôm nay của các tế bào gốc phôi cho các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm là dòng chuột teratocarcinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, RL, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) và teratocarcinoma con người (NTERA-2, Tera-2 , H-9 clone), cũng như Hess Trauneona. Tuy nhiên, sự hiện diện chi tiết hộ chiếu di động cho thấy kiểu hình miễn dịch, kết quả phân tích nhiễm sắc thể đặc trưng biểu hiện mRNA tiếp xúc với các thụ thể và protein truyền tín hiệu nội bào không bù đắp cho nhược điểm đáng kể teratokartsinomnyh dòng ESC - mất nhanh chóng của totipotency và bất khả thi của ứng dụng trong các thử nghiệm lâm sàng, và sự khác biệt hỗn hợp trong văn hóa là rất khó khăn để cô lập đường dây chuyên dụng tinh khiết từ một quần thể tế bào không đồng nhất. Do đó, thường là một nguồn dòng ESC sản xuất cho mục đích lâm sàng, phục vụ như là khối tế bào bên trong của phôi nang, phôi phôi bào cá nhân của giai đoạn 8 tế bào phát triển, tế bào phôi dâu giai đoạn sau, và tế bào mầm tiểu học.

Cần lưu ý rằng các tế bào ung thư biểu mô tuyến tụy, mặc dù chúng có thuộc tính đa năng, có tiềm năng đa năng thấp hơn rõ rệt so với ESC. Sự hội nhập của chúng với các tế bào phôi hiếm khi dẫn đến sự hình thành của chimeras, trong đó, ngoài ra, các giao tử với kiểu gen của tế bào ung thư biểu mô không được hình thành. Người ta tin rằng điều này là do sự xuất hiện thường xuyên của bất thường nhiễm sắc thể trong việc trồng các tế bào teratocarcin: một mất mát của nhiễm sắc thể Y, một loạt các trisomy, xóa, hoặc translocations.

Những nỗ lực để phân biệt dòng ESC của con người đã được thực hiện nhiều lần, nhưng công việc này không thể giải quyết được vì các phôi nang của người bình thường khó tiếp cận các vật thể. Ngoài ra, ở người, tần số của các bất thường về nhiễm sắc thể cao hơn so với sự sinh sản của con vật. Phần lớn phần lớn phôi người ở giai đoạn sớm được lấy sau khi thụ tinh trong ống nghiệm có mosaic nhiễm sắc thể hỗn độn và thường có sự sai lệch về số lượng và cấu trúc. Ngay cả sau đó, ở giai đoạn phôi nang, chỉ có 20-25% phôi người bao gồm các tế bào có karyotype bình thường. Gần như không thể sử dụng phôi như vậy để tạo ra một ESC, vì các zygot thường được nuôi cấy đến giai đoạn hai hoặc bốn blastomeres và sau đó được cấy vào tử cung. Chỉ gần đây mới có một kỹ thuật đáng tin cậy được phát triển để nuôi cấy các ống trứng người đã thụ tinh đến giai đoạn phôi nang. Việc đưa kỹ thuật này vào thực tiễn thụ tinh trong ống nghiệm không chỉ làm tăng tần suất của kết quả cấy ghép thành công mà còn làm cho phôi nang bình thường trở thành một đối tượng dễ tiếp cận hơn.

Một nguồn tế bào gốc đa năng là những tế bào quan hệ tình dục tiểu học, trong đó, trái ngược với các quần thể tổ tiên tiên tiến hơn germenativnogo biểu mô, không phải trên bề mặt của beta-integrin, nhưng bày tỏ hoạt động cao shelochnoy phosphatase. Cần lưu ý rằng trong thí nghiệm, quần thể tế bào gốc, được hình thành từ tế bào quan hệ tình dục ban đầu, đã được nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ trước. Đồng thời, một kỹ thuật để cô lập các tế bào mầm sơ cấp từ thô sơ của con chuột phôi đã được phát triển. Các kết quả không thành công đầu tiên của nuôi cấy tế bào mầm nguyên thủy in vitro cho thấy sự vô ích của những nỗ lực này, như các tế bào, mặc dù còn tồn tại, nhưng không sinh sôi nảy nở và chết trong ngày đầu tiên. Sau đó, người ta phát hiện ra rằng các tế bào mầm sơ cấp của chuột tái sản xuất trong ống nghiệm chỉ với sự có mặt của các yếu tố tăng trưởng polypeptide hòa tan và màng tế bào cụ thể trong môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nó là cần thiết sự hiện diện trong môi trường nuôi cấy không chỉ LIF, nhưng membrannosvyazannyh và yếu tố Thép-tan (SIF) cho sự sống còn và phát triển của các tế bào mầm nguyên thủy. Những peptide được sản xuất bởi phôi tế bào soma đồng hợp tử đối với đột biến của thép, và một trong số họ là một ligand của cKit proto-oncogene.

Các tế bào mầm sơ sinh của động vật có vú và người có nguồn gốc extragonadal và là nguồn gốc của sự phát triển dòng vô tính của dòng tế bào sinh dục. Bắt đầu từ dòng tế bào mầm nguyên thủy, cũng như tất cả các mô của phôi thai và trung bì extraembryonic cho epiblast (ngoại bì tiểu học) phôi sớm có tổ chức cấu trúc khảm. Việc cắt bỏ vi phẫu của các bộ phận khác nhau của phôi giai đoạn sớm đã thành lập một khu vực nội địa hóa trong epiblast của một bản sao của tiền thân cam kết của các tế bào mầm sơ cấp. Với sự trợ giúp của rhodamine dextran, được sử dụng như một marker đánh dấu tế bào, người ta đã xác định rằng các tiền thân của các tế bào tình dục chính nằm ở vùng epiblast ở gần, bên cạnh phôi thai ngoài phôi. Các dòng tế bào tình dục chính xuất hiện từ các tế bào 45-clone, sự phân bố đó xảy ra ngay khi bắt đầu gastrulation. Sau đó, sự phân tách clone xảy ra, và trong suốt quá trình dạ dày, các tế bào quan hệ tình dục đầu tiên xâm nhập vào mesoderm siêu âm và được tìm thấy trong cơ sở của chồi allantois, phía sau dải chính. Từ đó các tế bào mầm sơ cấp di chuyển về phía cuối của endoderm nội mạc tử cung và sau đó tích cực di chuyển dọc theo mesentery, populating các bộ phận sinh dục con lăn vào cuối di chuyển. Trong quá trình di cư, cũng như trong 2-3 ngày đầu tiên của sự nội địa hoá trong giai đoạn đầu tiên, các tế bào tình dục chủ yếu tăng nhanh và trải qua tám chu kỳ tái tạo. Nếu ở giai đoạn đầu di cư có khoảng 50 tế bào mầm sơ cấp, trong các phôi chuột sinh sản phát triển trong 12 ngày, số lượng tế bào cơ quan sinh dục chủ yếu vượt quá 25.000.

Sự tương tự chức năng của ESCs và các tế bào mầm nguyên thủy cho thấy hội nhập toàn diện sau này trong việc thay thế túi phôi khối tế bào bên trong và phát triển đầy đủ sau này của phôi thai, các mô trong đó bao gồm duy nhất của hậu duệ các tế bào mầm nguyên thủy. Theo đặc điểm khác chuột các tế bào mầm chính PGCs cũng giống hệt nhau, cho thấy khả năng biệt hóa thành các hướng khác nhau, để tạo thành cơ quan embryoid in vitro, một hình thức in vivo u quái khi tiêm dưới da vào chuột suy giảm miễn dịch giống như u quái tự phát chuột tinh hoàn dòng 129 / ter.

Nó được thành lập, khi bổ sung vào LIF trung bình, và membrannosvyazannogo tan SIF cô lập các tế bào mầm chính của 8 ngày phôi chuột tồn tại và sinh sôi nảy nở trong văn hóa trong 4 ngày nhưng sau đó chết. Hơn nữa, thời gian khi văn hóa sự chết quan sát các tế bào mầm nguyên thủy trùng hợp với giai đoạn phát triển của phôi chuột (12,5-13,5 ngày), khi tuyến sinh dục nữ các tế bào mầm lộc chính nhập giảm phân, và trong các tế bào mầm nguyên thủy nam bị chặn phân bào phân chia. Tuy nhiên, nếu bạn thêm vào môi trường không chỉ yếu tố tăng trưởng LIF và của SIF, mà còn của FGF2, các tế bào mầm tiểu học tiếp tục proliferirovat, các nền văn hóa được hình thành thuộc địa di động có thể tái tạo thậm chí sau khi bị loại bỏ khỏi môi trường của yếu tố tăng trưởng (SIF và FGF). Các tế bào như vậy có thể được nuôi cấy trong một thời gian dài trên nền nguyên bào sợi phôi mà không cần bổ sung LIF. Đó là những dòng tế bào ổn định này có nguồn gốc từ các tế bào mầm sơ cấp được cho là được gọi là tế bào mầm phôi. Thuật ngữ này không thể được coi là thành công như khi EG-tế bào nuôi không thể có được các tế bào mầm phôi thai, khả năng thực hiện các giai đoạn tiếp theo của oogenesis hoặc sinh tinh. Điều này là do thực tế là các dòng EG-cell, mặc dù có nguồn gốc từ các tế bào mầm nguyên thủy, nhưng trong văn hóa của việc mua các tài sản của các tế bào gốc đa năng phôi mất khả năng cam kết dòng germenativnye. Nói cách khác, các tế bào sinh dục chính bị mất các thuộc tính của tiền thân gamet sau khi canh tác và chuyển thành các tế bào đa năng như ESC.

Cần lưu ý rằng khi sử dụng các con chuột EG bị suy giảm miễn dịch, các khối u không phát sinh. Giả định rằng sự mất khả năng của các tế bào EG người bắt đầu u da do thực tế là những đường này không được tạo ra trực tiếp từ tế bào mầm sơ cấp nuôi cấy nhưng được lấy từ các tế bào phân lập từ thân phôi. Do đó, có thể họ là hậu duệ của các tế bào đa năng, nhưng đã cam kết.

Cần lưu ý rằng có sự khác biệt cơ bản giữa các tế bào EG và các tế bào mầm sơ cấp. Loại thứ hai không cho phép lấy phôi chuột chimeric, cho thấy sự thiếu khả năng của các tế bào mầm sơ cấp để hòa nhập vào khối lượng tế bào bên trong hoặc trophectoderm. Các đặc tính của quần thể các tế bào sinh dục chủ yếu tương tự như các dòng cam kết của tế bào soma của phôi sau đó, sự đưa vào trong phôi nang cũng không dẫn đến sự hình thành phôi chimer.

Kỹ thuật sửa đổi cấy các cơ quan embryoid thu được với EG-tập hợp của các tế bào cho phép lựa chọn trên môi trường chọn lọc để nhận thêm dân số của các tế bào gốc đa năng, được gọi là "các tế bào có nguồn gốc từ các cơ quan embryoid (tế bào có nguồn gốc cơ thể embryoid - EBD-cells). Khả năng của các tế bào EBD nhân lên trong một thời gian dài trong nền văn hoá cho phép tạo ra các dòng tế bào ổn định của các tế bào đã cam kết. Các dòng vô tính của các tế bào biểu hiện một phổ rộng của mRNA và các dấu hiệu protein của tế bào chuyên biệt đã được thu được. Cách tiếp cận này kết quả là chứng minh rằng các tế bào gốc đa năng nhân quan hệ tình dục tiểu học, và phân biệt in vitro vào nhiều loại hình tế bào: tế bào thần kinh, thần kinh đệm, nội mạc mạch máu, các tế bào tạo máu, cơ bắp, và các tế bào endodermal.

Các nguồn thay thế của tế bào gốc phôi

Nguồn thay thế của dòng ESC của con người có thể là tế bào lai. Cấy vào tử cung của cấu trúc bò pseudopregnant geterogenomnoy thu được khi sáp nhập qua electroporation fetusa tế bào soma của con người với những con bò trứng, mà trước đây đã được loại bỏ khỏi pronucleus, làm cho nó có thể nhận được các khối tế bào bên trong của tiền cấy phôi giai đoạn phát triển nhân tạo. Đối với điều này, phôi nang từ trứng của bò với hạt nhân được cấy ghép của tế bào người được thu được ở giai đoạn đầu tiên.

Trong giai đoạn thứ hai, phôi được lấy ra từ phôi nang, và từ đó - ESC theo phương pháp Thomson. Đáng chú ý là kết quả tốt nhất trong các dòng ESC tách bằng phương pháp này đã thu được sử dụng lõi của các tế bào nang trứng hoặc tế bào mầm nguyên thủy mà vẫn tồn tại trong cơ thể con người trong trạng thái ngủ đông. Điều này là do thực tế rằng trứng của bò cấy tế bào người neukorochennye hạt nhân nên có hoạt tính cao và telomere telomeazy mà tránh nhái ESC lão hóa sớm có nguồn gốc từ trứng lai (Repin, 2001). Người ta biết rằng các protein EGF đánh dấu quan trọng nhất trong tế bào là Oct 03, Oct 4, Tcf, Groucho, thuộc về cái gọi là protein thanh âm chromatin. Bộ phận giảm thanh bao bì đặc biệt đóng gói heterochromatin, ngăn ngừa sự hình thành các vòng euchromatin. Gói chromatin trung gian của các protein này tương quan với totipotency của bộ gen ESC. Cho đến nay, người ta đã xác định rằng trứng trưởng thành của gia súc và người là loại tế bào chuyên biệt duy nhất có chứa nồng độ protein silencer cao trong tế bào chất. Trên cơ sở này, một phương pháp đã được phát triển để sản xuất các tế bào ESC lai bằng cách chuyển các nhân tế bào của tế bào soma tới các ống trứng non của các con bò. Các nghiên cứu in vitro trước đây đã chỉ ra rằng tế bào chất của tế bào trứng của bò khôi phục sự tích cực của hệ gen nhân của tế bào soma người trong 12-24 giờ nuôi cấy.

Đặc biệt quan tâm là dữ liệu về các đặc điểm của sự phát triển của phôi người trước khi cấy ghép, cho thấy sự thay thế sau đó của các tế bào totipotent bởi một quần thể tế bào đa năng hơn là ở chuột. Nghiên cứu chuyển đổi tế bào cho thấy các tế bào của khối lượng tế bào bên trong của phôi nang của con người, ngoài ESCs, cũng tạo ra các tế bào trophoblast, cho thấy hiệu lực tổng thể của chúng.

Được biết rằng ở giai đoạn phôi nang có hai quần thể tế bào khác nhau. Một trong số đó là lớp ngoài của phôi nang, túi da, có nguồn gốc từ tế bào trophoblast và các thành phần bào thai thai ngoài phôi khác. Dân số thứ hai của các tế bào được nhóm thành một khối lượng dày, tiếp xúc với bề mặt bên trong của trophectoderm. Dân số tế bào của khối lượng tế bào bên trong bắt nguồn từ tất cả các mô và vi trùng của các bộ phận phôi. Ở giai đoạn cuối của phôi nang cuối, một endoderm phôi ngoài được hình thành từ khối lượng tế bào bên trong và một epiblast được hình thành (ectoderm chính). Đồng thời, các tế bào epiblast vẫn duy trì tính đa năng, trong khi khả năng phân biệt các tế bào của cực tiểu ngoài lòng màng tế bào là rất hạn chế.

[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]

Lấy tế bào gốc phôi người

Cho đến gần đây người ta tin rằng lá nuôi phôi lấy từ hESCs không thể. Tế bào gốc dòng trophectoderm Tuy nhiên lưỡng bội phân lập từ túi phôi trong môi trường chứa, thay vì LIF và FGF2 heparin, proliferates và được biến đổi thành tế bào gốc. Nếu bạn loại bỏ từ giữa FGF2, các tế bào trophectoderm dừng chăn nuôi, họ bắt đầu endoreduplication của nhiễm sắc thể và các yếu tố tế bào trofektodermalnye dần dần chuyển thành một tế bào lá nuôi phôi khổng lồ. Có lẽ, LIF không kích thích sự tăng sinh của các tế bào trophectoderm do thực tế rằng FGF2 gây nên một transsignalizatsii cơ chế như FGF2, gắn vào thụ thể tế bào chất (FGFR2), kích hoạt kinase MAP trong tế bào chất - ERK1 và ERK2. Do đó, khi đưa vào các tế bào của phôi nang của một đường tín hiệu (LIF - gpl30 - JAK-kinaza - STAT3) các tế bào khối tế bào bên được chuyển thành hESCs đa năng, trong khi kích hoạt cơ chế thứ hai của màng tín hiệu (FGF2 - FGFR2 - MAP kinaza ERK1 / ERK2) Trong phôi nang, tế bào gốc của trophectoderm được hình thành. Lựa chọn con đường truyền tín hiệu, đến lượt nó, phụ thuộc vào hoạt động của Oct4 gen. Gen thuộc lĩnh vực này POU, nằm ở locus t 17 NST thường và được thể hiện trong oogenesis, trong giai đoạn nghiền cũng như trong các tế bào của khối tế bào bên trong của phôi nang, và trong các tế bào mầm nguyên thủy. Gen vai trò Oct4 chức năng được mã hóa là một yếu tố phiên mã cần thiết cho sự xuất hiện của các tế bào gốc toàn năng, sự khác biệt và dedifferentiation của họ.

Sự biểu hiện của gen oct4 trong ESC thay đổi tùy thuộc vào sự tương tác của yếu tố phiên mã này với các đồng tử. Một quy định hướng về sự biểu hiện của oct4 trong phôi nang đã chỉ ra rằng, với sự giảm hoạt động của nó, một nửa số tế bào tạo thành trophectoderm, trong khi đó sự gia tăng biểu hiện gây ra của oct4, chủ yếu là ESC xảy ra.

Trong thí nghiệm, ESC không thể chuyển đổi thành một dòng khi trồng các blastomeres totipotent ở giai đoạn nghiền, và cũng ở giai đoạn gastrulation và các giai đoạn sau của sự phát triển phôi thai. Chuột ESCs thường phân bổ ở 3.5-4.5 ngày thai kỳ, tương ứng với thứ sáu (lớp duy nhất của phôi nang) và giai đoạn thứ bảy (hai lớp túi phôi - một xi lanh trứng sớm) phôi bình thường. Rõ ràng, chỉ trong giai đoạn preimplantation phôi của chuột có chứa tế bào di chuyển có thể chuyển thành ESC. Do đó, việc cô lập các dòng ESC chỉ có thể xảy ra ở những giai đoạn nhất định của phôi thai. Totitipotent, từ quan điểm về khả năng phát triển một phôi thai có thể sống được với màng phôi và nhau thai, là các zygote và các blastomeres phát sinh trong quá trình nghiền. Việc mất toàn bộ sức mạnh của tế bào mầm bắt đầu ở giai đoạn cuối của giai đoạn cuối, khi sự tàn nha của blastomere phụ thuộc vào vị trí của chúng. Morula blaetomers sớm duy trì tính totipotency, bởi vì các thao tác thí nghiệm với sự thay đổi vị trí, ví dụ, đảo ngược vị trí của chúng, không ngăn cản sự phát triển của một phôi hoàn chỉnh.

Nó đã được tìm thấy rằng hiệu quả của việc phát hành ESC trong đường dây bị ảnh hưởng bởi trạng thái của phôi nang ở thời điểm bóc ra của họ. Việc sử dụng phôi nang sau khi mô hình một thời gian 7 ngày diapause trong bộ phận sinh dục của chuột bị cắt bỏ vào ngày thứ 3,5 của thai kỳ và nhận progesterone thúc đẩy sự phân bổ thành công hơn các dòng tế bào gốc phôi. Giả định rằng trong những điều kiện như vậy số lượng các blastomeres hình thành nên khối lượng tế bào bên trong tăng lên. Cũng có thể là chu kỳ tế bào kéo dài và hầu hết các blastomeres đi vào giai đoạn G0.

Hơn nữa, việc tạo ra các dòng hESC đa năng ổn định phụ thuộc vào phôi kiểu gen: khá dễ dàng phân biệt với ESCs Murine phôi nang dòng 129, là đáng kể khó khăn hơn để có được chúng sử dụng chuột CS7BL / 6 và hầu như không thể để cô lập các dòng từ hESCs phôi nang CBA / Cà chuột. Rõ ràng, phôi sớm có một số đặc điểm di truyền ảnh hưởng đến sự phát triển của dòng ESC đa năng. Tuy nhiên, khi epiblast nuôi cách ly, cũng như bởi sự lựa chọn có chọn lọc phân biệt dòng tế bào hESCs từ phôi sớm CBA / Cà chuột vẫn được phân bổ.

Một kỹ thuật chuẩn đã được chứng minh để lấy dòng ESK từ phôi nang được đưa ra trong hướng dẫn sử dụng phòng thí nghiệm về kỹ thuật thí nghiệm với phôi sớm. Các dòng ESK thử nghiệm cũng có thể thu được bằng cách nuôi cấy epiblast bị phân lập (phôi nang ban đầu) của phôi chuột kéo dài 4,5 ngày với kỹ thuật vi phẫu phức tạp và điều kiện canh tác cải tiến. Sự phức tạp của thủ tục này là hợp lý, vì tần suất hình thành các dòng ESC cao hơn nhiều so với công việc với khối lượng tế bào bên trong của phôi nang.

Để cô lập các dòng ESC, mỗi clone được chuyển đến một giếng khoan, tổng cộng 40-60 tế bào được trồng, nó lại phân tán. Nhiều lần lặp lại của thủ tục này cho phép để có được bất tử phù hợp với các tế bào normokariotipnyh tỷ lệ phổ biến vũ khí tối đa kèm theo nhựa, mà thông qua đoạn 50-100 giữ totipotency và hoạt tính của telomerase cao ESK. Trong quá trình hỗ trợ dòng ESC, ô nhiễm môi trường hoặc huyết thanh với endotoxin vi khuẩn là nguy hiểm nhất - thậm chí theo dõi nồng độ endotoxin trong môi trường nuôi cấy gây chết người lớn của tế bào mầm. Với kiểm soát cẩn thận của sự phát triển tuyến tính và phân tán kịp thời ESCs trong văn hóa có khả năng phân hạch đối xứng, trong đó cả hai tế bào con vẫn đa năng và có khả năng thực hiện một số không giới hạn của chu kỳ tế bào, duy trì một karyotype lưỡng bội và tổng tiềm năng.

Lựa chọn một quần thể sạch ESC của con người có thể được thực hiện sau khi chuyển vào bộ gen của các phân tử ADN tái tổ hợp có chứa một gen mã hóa cho sự tổng hợp của một protein huỳnh quang xanh (GFP). Biểu hiện GFP tăng lên cùng với sự tăng trưởng của ESC trong điều kiện hỗ trợ sự tăng sinh của chúng, trong khi với sự khởi đầu của sự khác biệt, mức biểu hiện của gen này sẽ giảm, cho phép lựa chọn các dòng tế bào đa năng ổn định ổn định trên môi trường chọn lọc. Khi được gieo trồng với sự lựa chọn ESC của GFP, tần suất của các khuẩn lạc sẽ tăng lên đáng kể, vì trong điều kiện chọn lọc, hiệu quả chống lan nhanh của các tế bào phân biệt được loại bỏ.

Bản dịch của tế bào gốc phôi người phù hợp bằng phương pháp của họ bị cô lập của phôi preimplantation (bước 80-120 tế bào), tiếp tục sau các vitro thủ tục thụ tinh trong. Đối với điều này, phôi "thừa" nhân tạo được phân tán bằng máy trong môi trường Delbecco-Needle. Sau khi đánh dấu các tế bào với các kháng thể đơn dòng chọn lọc với một nhãn huỳnh quang, các tế bào của phôi được phân lập. Phôi thai được phân tán thành các tế bào cá nhân sử dụng một hỗn hợp disaspase-collagenase. Tế bào phân ly được trồng trong môi trường đặc biệt (80% Delbekko vừa + 20% huyết thanh thai bê trong sự hiện diện của 500 .mu.g / ml IL-6, LIF và SCF) trên đơn lớp của các nguyên bào sợi phôi Feeder 3 đoạn đầu tiên. Trong trường hợp này, sự sống sót và sự gia tăng của tế bào gốc và tế bào tiền thân được hỗ trợ khi tiếp xúc với IL-6, LIF và SCF. Trong môi trường như vậy, ESCs phát triển bằng cách nhân bản vô tính của các tế bào bị sáp nhập không liên kết, mà phải được tách ra bằng cách pipet nhiều nhẹ nhàng. Các dòng vô tính mới xuất hiện trong nền văn hoá bị đình chỉ vào ngày thứ 5-7. Tốc độ tăng trưởng cao nhất của ESC đạt được nhờ sự phân ly lặp lại của các dòng vô tính ở giai đoạn 10-15 tế bào. Sau đó, mỗi một clone được chuyển tới một microcell và được phát triển thành tổng cộng 40-50 tế bào. Quy trình được lặp lại nhiều lần trong các đoạn văn, làm tăng thể tích nuôi cấy lên mật độ 5-10 triệu tế bào / ly 6 cm. Bằng cách sử dụng như một Thomson passaging nó được phân lập 10 nhái ESCs con người bất tử mà qua đoạn 100 duy trì hoạt tính của telomerase cao, khả năng phổ biến vũ khí mãnh liệt và đặc điểm kiểu hình tối thiểu tổng tiềm năng, với sự khác biệt trong bất kỳ của 350 dòng tế bào chuyên dụng có nguồn gốc ecto-, meso- - và endoderm. Sự khác biệt của con người bắt đầu ESC (ít thay đổi của môi trường, bổ sung và loại bỏ các LIF huyết thanh) với tập tin đính kèm tế bào đến bề mặt, cho thấy sự phát triển của khung tế bào và biểu hiện của thụ thể bám dính. Điều quan trọng là với sự gia tăng không hạn chế của ESC con người, một karyotype bình thường đã được bảo tồn.

Phương pháp thứ hai của việc cô lập các dòng ESC của con người dựa trên việc sử dụng các tế bào sinh dục chủ yếu. Các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng các đường tế bào Eu có thể thu được từ màng bộ phận sinh dục của phôi 12,5 ngày tuổi của chuột. Tuy nhiên, trong những trường hợp này, tần suất hình thành các dòng tế bào gốc là thấp hơn đáng kể so với các thí nghiệm với phôi trước đó. Đồng thời, các tế bào quan hệ tình dục chủ yếu từ phôi chuột ở tuổi thai 13,5 ngày nói chung không có khả năng biến thành đường.

Các dòng ổn định đầu tiên của tế bào EG người có năng lực thu được từ các tế bào mầm non chính được phân lập từ nụ sinh dục của phôi bào thai 5-9 tuần tuổi. Tế bào cô lập được nuôi trên bề mặt của bất hoạt chuột nguyên bào sợi phôi trong DMEM trung với huyết thanh bào thai, mà đã được bổ sung mercaptoethanol, forskolin, cũng như yếu tố tăng trưởng con người tái tổ hợp (FGF và LIF). Sau 7-12 ngày, các khuẩn lạc đa bào xuất hiện trong môi trường nuôi cấy, theo các đặc điểm hình thái và các dấu phân tử tương ứng với tế bào EG người. Sau khi tập hợp, các tế bào này tạo thành các phôi bào thai, với sự phát triển thêm của các tế bào chuyên biệt xuất hiện, đặc trưng cho các dẫn xuất của cả ba lá phôi. Trong suốt 10-20 đoạn văn Các dòng tế bào EG giữ nguyên karyotype bình thường và không mất tính đa năng.

Nó cũng chỉ ra rằng hiệu ứng kết hợp của LIF, các thành phần của chất kết dính màng và hòa tan, cũng như TGF-b, điều chỉnh chương trình phát triển các tế bào mầm sơ cấp. Thay vì dừng phân chia tế bào và bắt đầu phân biệt đối với sự phát triển của tế bào hoặc tinh trùng, các tế bào tình dục chính tiếp tục tăng lên. Sau một vài chu kỳ phân bào bổ sung chúng trở nên tương tự như các tế bào epiblast và, mất đi tính chất của tiền thân của tế bào mầm, chuyển thành các tế bào EG phôi đa năng.

Do đó, vào năm 1998, các đường sinh dục sơ khai bị cô lập lần đầu tiên được phân lập từ các nguyên nhân về tình dục của mô tử tử cung của người. Các phôi của các tế bào mầm nguyên nhân xuất hiện trong túi noãn hoàng trong tuần thứ ba của sự phát triển, và trên những tuần 4-5th, các tế bào này di chuyển vào khu vực của củ nảo tình dục, nơi chúng tạo thành một quần thể gonocytes dormantnye chính. Trong trạng thái không hoạt động, các tế bào mầm sơ cấp vẫn còn trong chồi cho đến khi sinh. Dòng tế bào mầm chính được chiết xuất từ củ nảo bộ phận sinh dục phôi 5-9 tuần tuổi của thai nhi lấy cựu vải lâm thời được điều trị bằng một hỗn hợp của loại collagenase IV-V, hyaluronidase và DNase cho năng suất tăng tế bào định lượng và định tính. Các tế bào mầm sơ cấp trong các mô của cơ quan sinh dục bào thai được bao quanh bởi các tế bào đáy Sertoli (mesenchymal). Mục đích chức năng của các tế bào Sertoli là việc sản xuất các yếu tố chống apoptosis (Fas-ligand), mitogen, và các đại lý ức chế miễn dịch bảo vệ tế bào gốc tình dục khỏi bị tấn công miễn dịch của cơ thể. Ngoài ra, môi trường vi sinh của ổ sinh dục có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của giao tử. Các tế bào mầm sơ cấp bị cô lập được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy trên lớp tầng đệm thức ăn bao gồm các nguyên bào sợi bào thai của ba đoạn đầu tiên. Sự kết hợp hiệu quả nhất của mitogen được công nhận là một tổ hợp bao gồm LIF, FGF và forskolin (cAMP hình chất kích thích). Tăng sinh các tế bào mầm nguyên thủy trong ống nghiệm đòi hỏi việc bổ sung huyết thanh bào thai, trong sự hiện diện của một gonocytes sinh sản chính trong các dòng văn hóa kèm theo sự hình thành của các tế bào hình cầu, không bám chặt vào bề mặt.

Viện Quốc gia Hoa Kỳ Y tế trên cơ sở tổng hợp thông tin hiện có về các phương pháp phân bổ dòng ESC con người từ phôi nang đã được thực hiện một kết luận sơ bộ rằng việc phân bổ thành công của ESC là nhiều khả năng khi phôi nang nuôi với tốt được hình thành khối tế bào bên (Tế bào gốc: tiến bộ khoa học và phương hướng nghiên cứu trong tương lai Nat, Viện Sức khoẻ Hoa Kỳ). Từ quan điểm này, các nguồn tốt nhất của ESCs để tạo ra dòng này là con người phôi nang ngày 5 của sự phát triển, trong đó có việc phân bổ khối tế bào bên trong phải được loại bỏ một cách cẩn thận trophectoderm. Cô lập khối tế bào bên gồm ở giai đoạn này của 30-35 tế bào phải được trồng trên các nguyên bào sợi phôi chuột bề mặt, đó là một điều kiện quyết định cho sự hình thành của các thuộc địa trong văn hóa hESCs.

Phân tích các đặc tính kiểu hình của tế bào gốc phôi

Đặc biệt quan tâm là phân tích so sánh các đặc tính hình thái của ESC. Người ta thấy rằng các thuộc địa ESC con người - một cụm dày đặc của các tế bào biểu mô dẹt, trong khi những con chuột embryoid bê bao gồm tập đoàn lỏng lẻo của các tế bào tròn. Ở con người ESC, chỉ số tỷ lệ hạt nhân-plasma thấp hơn so với chuột ESK. Các tế bào gốc phôi của khỉ hình thành các khuẩn bào phẳng hơn với các cạnh không đồng đều. Trong các dòng vô tính ban đầu của động vật linh trưởng ESC, các tế bào đơn có thể dễ dàng nhìn thấy. Phát triển hạt nhân hESCs tất cả các loài động vật không thể hiện MHC lớp I và II. Đồng thời, ESCs con người đưa ra một phản ứng tích cực đối với kháng thể TERA 1-60 và GCTM-2, mà chỉ ra sự hiện diện trên bề mặt tế bào gốc -kartsinomnyh keratin / chondroitin sulfate proteoglycans, đặc trưng của phôi (u quái) của họ. Biểu hiện trong hESCs tất cả các loại gen động vật Oct4 gợi ý rằng, bất chấp sự khác biệt về kiểu hình ở ESCs con người và chuột, rõ ràng kích hoạt bởi cùng một bộ gen chịu trách nhiệm về việc duy trì pluripotency (Peru, 2001). Bên cạnh đó, dòng ESC có nguồn gốc từ những con chuột phôi, lợn, thỏ, động vật linh trưởng, và gia súc, có những đặc điểm hình thái tương tự, một bộ tương tự như nhận dạng phân tử của các dấu hiệu và một cơ chế phân tử gần giống hệt nhau cho việc thực hiện các chương trình phôi cho phép bạn để có một cái nhìn mới về vấn đề xenotransplantation .

Không giống như phôi bình thường trong cơ thể, trong ống nghiệm gia tăng của hESCs không kèm theo sự hình thành của các lớp mầm và tiền thu được để chặn homeotic Nohgenov nền, nghĩa là không phải cơ quan. Kể từ gen Phân khúc không hoạt động trong văn hóa hESCs không thể để tái tạo các giai đoạn như vậy phôi như tab đốt của côn trùng phân hóa giữa các hạt nhân, sự hình thành của túi noãn hoàng, allantois theo điều kiện và các bộ phận cơ thể và các mô. Các ESC văn hoá đã được đông lạnh vào đầu sự hình thành của 350 dòng hạn chế của các tế bào chuyên biệt. Do đó, các tế bào nguyên bản sao công ty con và PGCs cục bộ trực thuộc Trung ương chỉ mô hình phôi quá trình phát triển, trong đó khu vực mô khác nhau được hình thành trong một giai đoạn là khác nhau từ các tế bào chuyên biệt có nguồn gốc, tuy nhiên, từ các tiền chất chung. Mặc dù mức tối thiểu của các thụ thể trên bề mặt của hESCs, chúng vẫn giữ được khả năng thực hiện các quá trình hình thái nguyên thủy mô phỏng phần lớn các cấu trúc phôi sớm: hESCs bùn trong văn hóa và uẩn tạo thành một cấu trúc giống như túi phôi hoặc thậm chí sau đó phôi (xi lanh trứng). Các hợp chất huyền phù này được gọi là các cơ thể phôi phức hợp đơn giản và phức tạp.

Khi trộn biệt hóa thành các tế bào khác nhau của cơ thể embryoid đồng thời bày tỏ bởi gen ngoại bì sớm (oct3, FGF-5, đầu mối), nội bì (gata-4), trung bì (brachyury), tim trung bì (PKH-2,5), ống thần kinh (msx3 ) và hematopoiesis (elkf). Sử dụng kết hợp khác nhau của các cytokine và các yếu tố tăng trưởng để nhắm mục tiêu sự hình thành của các tế bào lớp mầm trong ống nghiệm trong một số trường hợp nó đã có thể có được cơ quan embryoid, mà tốt nhất là được thể hiện gen ngoại bì hoặc trung bì, mà mở đường cho mô hình của gastrulation và giai đoạn phát sinh cơ quan sớm.

Tăng trưởng vô tính của hESCs là bằng chứng về sự phân chia tế bào không đối xứng trong đó chỉ có một trong những ESC trong clone trung tâm giữ lại không hạn chế khả năng sinh sản, trong khi các tế bào con gái khác làm phát sinh sang thế hệ khác của các tế bào, sự khác biệt đã đến ở. Do đó, tỷ lệ nhân của nhân bản ở ngoại biên của cơ thể phôi cao hơn ở trung tâm. Các tế bào cận biên của clone đang phát triển trải qua sự phân biệt tự phát rối loạn, di chuyển hoặc chết do cơ chế apoptosis. Những sự kiện này xác định số phận của clone nếu tỷ lệ phổ biến vũ khí vượt quá tỷ lệ di cư và chết tế bào apoptosis, tạo bản sao kích thước tiếp tục tăng, ổn định xảy ra với apoptosis bằng và tỷ lệ hình thành của vận tốc di động mới, hồi quy - tỷ lệ ngược lại quá trình này. Các tế bào tiền liệt phân chia theo hình thức đối xứng, nghĩa là cả hai tế bào con gái được phân biệt xa hơn nữa thành các dòng tế bào chuyên biệt đã trưởng thành. Tỷ lệ ESC / tế bào tiền thân thay đổi, nhưng luôn luôn số lượng ESC chỉ là một phần của một phần trăm dân số tế bào tiền thân. Do đó, chỉ cần cẩn thận pipetting và phân tổ kịp thời các dòng vô tính có thể làm tăng số ESCs trong văn hoá. Để đạt được sản lượng ESC tối đa, hiệu quả nhất là phân tổ các dòng vô tính ở giai đoạn 10-12 tế bào. Hướng và mức độ phân biệt của các tế bào trong cơ thể phôi phụ thuộc vào vị trí của chúng. Các tế bào cơ thể embryoid ngoài không biểu hiện gen và Oct4 trải qua sự khác biệt trong các tế bào nội bì chính từ mà sau đó hình thành các tế bào biểu mô và đỉnh extraembryonic nội bì nội tạng. Các tế bào trong của cơ thể phôi thể hiện gen oct4 và duy trì tính đa năng trong 48 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, sau đó sắp xếp lại hình thái văn hoá diễn ra trong lớp đơn sắc biểu mô và biểu hiện của các gen kiểm soát sự phát triển của ectoderm chính bắt đầu. Sau đó, bắt đầu quá trình tổng số rối loạn cytodiference với sự xuất hiện của các loại tế bào khác nhau là các dẫn xuất của cả ba tấm miễm sinh. Trong quá trình phân hóa tự phát của các tế bào cơ thể embryoid đầu tiên nảy sinh uẩn dấu nội bì ở dạng mảnh (nang) yolk sac. Hơn nữa, angioblasts và các tế bào màng trong mao mạch phát triển xuất hiện trong các cấu trúc này. Trong giai đoạn cuối cùng của sự khác biệt tự phát của các tế bào bên trong của cơ thể embryoid phát triển tế bào ở giai đoạn cuối phân biệt khác nhau, bao gồm tế bào thần kinh, yếu tố thần kinh đệm, cardiomyocytes, đại thực bào và tế bào hồng cầu. Trong xấp xỉ nhất định (xem xét các đảo ngược không gian của tấm hình thành các mô phôi) thông qua các cơ quan embryoid in vitro có thể khám phá quá trình hình thái và phân tích các cơ chế phân tử của giai đoạn đầu cytodifferentiation phôi, và thiết lập vai trò của gen cụ thể trong việc thực hiện các quá trình này.

Do đó, bên trong clone là các tế bào, trong đó phát hiện các chương trình phát triển di truyền khác nhau - ESCs, các tiền thân sớm và phân biệt các quần thể tiên phong. Việc trồng ESC bằng phương pháp thả rũ xuống hoặc nuôi cấy khối lượng mà không có lớp thức ăn và không có sự bổ sung LIF trong môi trường chắc chắn sẽ dẫn đến sự hình thành các phôi thối. Hình thái học của các tế bào của các lớp bên ngoài và bên trong của các cơ thể phôi là khác nhau. Lớp ngoài bao gồm các tế bào quy trình lớn. Bề mặt của chúng, đối mặt với môi trường, được bao phủ bởi rất nhiều lớp vi nhỏ. Lớp ngoài của các tế bào được tách ra từ màng nền bên trong giống như màng Reichert, trong khi các tế bào của lớp bên trong của cơ thể phôi là một biểu mô hình trụ. Về mặt hình thái học, lớp bên trong, mặc dù chứa nhiều tế bào phân chia, gợi nhớ nhiều hơn các khuẩn lạc ESC không phân biệt.

Các tính năng của tế bào gốc phôi người

Sự vắng mặt của các tương tác nhu mô-trung mô vào tín hiệu nền chặn gen homeosis gây mất trật tự tăng trưởng của PGCs trong văn hóa, kể từ tab này bị phá vỡ và cơ sở hạ tầng hình thành các bộ phận theo điều kiện. Tăng trưởng chưa được tổ chức và sự khác biệt tự nhiên mất trật tự của hESCs trong văn hóa do thiếu đánh dấu khuôn khổ mô đệm của các cơ quan tương lai trung mô: in vitro có thể sự hình thành của hàng triệu tế bào gan, nhưng bạn không thể nhận được bất kỳ phân đoạn của gan, trong đó có yếu tố cấu trúc và chức năng như vậy, chẳng hạn như các xoang, không gian của các tế bào Disse và Kupffer.

Người ta tin rằng các pluripotency của ESCs nhận độc quyền trong phôi để hình thành các mô và các cơ quan của phôi thai, trong khi dây rốn và nhau thai được lấy lá nuôi phôi. Kèm theo trong một vỏ trofektodermalnuyu ESK liên tục tạo ra các dòng tế bào định tạm thời thực hiện các chương trình phát triển của mRNA tổ hợp số lượng lớn Nohteyaov địa hình ma trận, trong đó dự định tổ chức không gian, hình dáng, kích thước, số lượng tế bào cơ quan tạm thời và dứt khoát và lắp ráp nhu mô trong đơn vị cấu trúc và chức năng. Đồng thời các ESC là loại tế bào duy nhất mà các cơ chế phân tử của thực hiện tiềm năng của họ hoàn toàn tách ra từ các chương trình di truyền của sự phát triển và ESCO mình bị tước đoạt khả năng tương tác với các tế bào khác do sự tắc nghẽn của cả hai nhận thức thụ và hệ thống transsignalizatsii. Tuy nhiên, đầy đủ ESCs kích hoạt kết quả trong từng bước triển khai phôi sinh chương trình kết thúc là hoàn toàn hình thành và sẵn sàng cho cuộc sống ngoài tử cung của một sinh vật gồm hàng tỷ tế bào. Trong thời gian ngắn này, nhưng nợ không thể tưởng tượng trong đường dẫn không gian xảy ra không thể tránh khỏi tế bào của sai sót trong cơ chế phân tử mà cung cấp các chức năng quan trọng của tế bào, và trong các chương trình kiểm soát sự phát triển, sự khác biệt và chuyên môn của họ. Do đó, trong pharmacogenomics hiện đại coi bệnh riêng các thiết bị phân tử, và lập trình tế bào bệnh. Và hành động của đa số các loại thuốc mới nhằm sửa tên của chương trình của sự khác biệt, sự phát triển và phát sinh cơ quan, cũng như sự tái sinh của các cơ quan và các mô. Trong cơ thể người lớn qua ESCs nó trở thành có thể để kiểm soát hành vi của tế bào gốc / tổ tiên cấy vào não, gan, lá lách, tủy xương và các cơ quan khác của con người để sửa chữa một bộ phận nhu mô nhận bị hư hỏng do các tế bào trung mô các nhà tài trợ khác biệt và chuyên môn hóa được bảo tồn ma trận. Về cơ bản, chương trình totipotency đang tung ra một bộ gen của tế bào trứng mực, hợp tử và phôi bào, nhưng các tế bào này chưa thể sao chép và cấy truyền trong số lượng cần thiết cho nhu cầu của y học thí nghiệm và thực tiễn. Do đó, ESC là một nguồn duy nhất của thông tin di truyền chứa bản đồ ba chiều tuyến tính hạn chế của phôi thai và mã của dòng tế bào chuyên trong gastrulation.

Hầu như khả năng vô hạn của tái sinh ESC do thực tế rằng bộ gen của họ, ngược lại với bộ máy di truyền của tế bào soma biệt, duy trì pluripotency. Một biểu hiện của trạng thái không hoạt động bắt nguồn từ thông tin di truyền ESCs là cái gọi là kiểu hình tối thiểu - trên bề mặt của ESC thể hiện một số hạn chế về các thụ thể, và do đó được triển khai rất ít các chương trình tương tác thiết bị hạt nhân transsignalizatsii của tế bào với vi môi trường của nó. Trong bối cảnh của gen ngủ đông chịu trách nhiệm về những hạn chế của dòng tế bào chuyên biệt và các tế bào, chỉ có khoảng 30 trong số 500 gen có sản phẩm cung cấp cho các tế bào giao tiếp với vi môi trường xung quanh kích hoạt. Sử dụng phương pháp phân tích serial của biểu hiện gen chỉ ra rằng tính tổng quát của các hộp gen chức năng chính điều tiết năng lượng và trao đổi chất trong tế bào soma và ESCs trong cuối cùng xác định số lượng cực kỳ thấp của mRNA của các thụ thể, G-protein, sứ giả thứ hai, transcriptases, đồng yếu tố biểu hiện và đàn áp , nghĩa là, toàn bộ hệ thống truyền màng tế bào của tín hiệu điều tiết vào tế bào. Điều này là do thiếu hoặc biểu hiện rất ít gen chuyển gen. Trong quá trình phân hóa gây ra trong bộ gen của ESC 18 hoạt động được ngừng hoạt động đồng bộ gen cho nền kích hoạt transsignalizatsii 61 gen kiểm soát sự tổng hợp của các thụ thể tế bào bám dính, thành phần ma trận ngoại bào, hạn chế transcriptases yếu tố messendzhernyh và hệ thống truyền tín hiệu cho một đơn vị hạt nhân với các thụ thể màng tế bào plasma. Đồng thời chặn biểu hiện của gen chịu trách nhiệm cho quá trình tổng hợp protein giảm thanh, cũng như biểu hiện gen koingibitorov cung cấp hESCs gen totipotency.

Các dấu hiệu di truyền đã được tìm thấy cho các tế bào của cả ba tờ phôi thai. Xác định lớp tế bào ngoại bì thực về sự biểu hiện của gen nút, oct3 và FGF-5, các tế bào mesodermal - brachyury gen, zeta-globin, nội bì - ít biểu hiện gen gata-4. Trong phôi bình thường, trong gastrulation quan sát một chuyển đổi hoạt động của các quần thể chưa trưởng thành của tế bào gốc và tổ tiên, tại địa phương chỉ định khu vực của xương mặt của hộp sọ, một số bộ phận của não, hệ thần kinh ngoại vi, hệ thống dẫn truyền tim và mô tuyến ức được hình thành từ nhái dời các tế bào. Ghi nhãn tế bào gen đầu lớp mầm làm cho nó dễ dàng hơn để phân tích địa hình di cư của các tế bào trong phôi thai đang phát triển. Nó được tìm thấy ở cụ thể mà các tế bào trong biểu P19 uẩn embryocarcinoma của brachyury gen trung bì đầu tiên bắt đầu trong việc giảm biểu hiện gen của activator mô plasminogen, một-fetoprotein, keratin 8, và keratin 19, đó là dấu hiệu của dân di cư trung bì sớm. Do đó, sự hình thành của mô xuất xứ mesodermal bắt đầu chỉ sau khi quá trình tế bào mesodermal tổ tiên di cư và điểm định cư.

Với những tính năng kiểu hình vô cùng hạn chế và sự vắng mặt của hầu hết các khối transsignalizatsii ESC vẫn thể hiện một số phân tử thụ thể có thể được sử dụng để nhận dạng chúng. Đáng chú ý là các kháng nguyên là dấu hiệu của ESC ở người và động vật linh trưởng đã được phổ biến. Thường được dùng cho hESCs ghi nhãn dán nhãn kháng thể đối với kháng nguyên membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (kháng nguyên lipid độc đáo đại diện cho GL7 glycolipid phức tạp với axit sialic), cũng như glycoprotein polymer cao TRA-1-81, TRA-1-60. Hơn nữa, hESCs thể hiện cụ thể kháng nguyên phôi SSEA-1 và phosphatase kiềm nội sinh, cũng như một yếu tố phiên mã cụ thể Oct4. Loại thứ hai là cần thiết cho việc duy trì cơ chế phổ biến vũ khí hESCs - gen yếu tố phiên mã cụ thể Oct4 kích hoạt sự biểu hiện của tăng trưởng nguyên bào sợi nhân tố 4 biểu hiện gen và ổn định đấm bốc chịu trách nhiệm cho người không hạn chế sự nhắc lại DNA trong các tế bào chưa trưởng thành. Các protein marker trong tế bào quan trọng nhất là Oct3, Oct4, TCF và Groucho, liên quan đến các protein của nhiễm sắc thể-bộ phận giảm thanh.

Hầu như ngay lập tức sau khi ESCs nỗ lực nuôi dài hạn là không thành công và sinh vật đã được chuẩn bị đầu tiên nhờ việc nuôi cấy tế bào gốc phân lập từ phôi nang chuột, và nuôi cấy tế bào mầm tiểu học, bắt đầu nghiên cứu khả năng ESC pluripotency giai đoạn khi dùng trong giai đoạn đầu của sự phát triển phôi. Người ta thấy rằng ở phôi dâu và phôi nang PGCs có thể để tạo thành phôi khảm trong đó PGCs nhà tài trợ con cháu phát hiện trong tất cả các mô soma và ngay cả trong giao tử. Như vậy, trong Sinh học phát triển sử dụng ESC kịch bản "cầu nối" giữa các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và in vitro, trong đó tăng đáng kể khả năng nghiên cứu các quá trình Bookmarks mô chính và các cơ quan, sự khác biệt của họ và phát sinh cơ quan phôi.

Nó cũng được thành lập mà in vivo trong phôi ESK tích hợp vào khối tế bào của phôi sớm, và các dẫn xuất của họ được tìm thấy trong tất cả các cơ quan và các mô. PGCs định cư ở các dòng mầm của một tế bào mầm khảm, con cháu trong đó hình thành trứng và tinh trùng đầy đủ. Tế bào gốc phôi là clonogenic - PGCs duy nhất có thể tạo ra gen giống với một thuộc địa của các tế bào với các marker phân tử, trong đó bao gồm biểu Oct4 gen và phosphatase kiềm, hoạt tính của telomerase cao, cũng như biểu hiện của kháng nguyên phôi cụ thể.

Nghiên cứu cơ chế của phôi bằng cách sử dụng kỹ thuật của hESCs chimerization dâu bằng cách tạo ra một cấu trúc sinh học, được đặt bên ngoài lớp phôi bào tứ bội người nhận và các nhà tài trợ PGCs được quản lý vào. Như vậy, lá nuôi phôi hình thành từ hậu duệ tứ bội phôi bào nhận cho phép cấy và placentation, và PGCs nhà tài trợ đóng vai trò là khối tế bào bên trong, mà được hình thành từ một dòng mầm khả thi của các giao tử cơ thể và tổ tiên ban đầu. Giá trị nghiên cứu ESC không chỉ nằm ở đó, khi thao tác in vitro với bộ gen của họ giữ lại pluripotency, mà còn trong thực tế là trong khi bảo tồn khả năng tham gia vào sự hình thành của các tế bào mầm nguyên thủy hESCs của phôi thai khảm. Người ta chỉ ra rằng chỉ có một con đẻ của PGCs biến đổi gen cư tất cả các vi trùng tiểu học và hình thành vải phôi khảm thu được bằng cách kết hợp hoặc coculture của các tế bào với phôi 8 tế bào. Khi cấy vào chuột ESCs dâu transfected với gen protein huỳnh quang màu xanh lá cây, con cháu huỳnh quang của các tế bào được tìm thấy trong tất cả các mô điều tra của phôi thai đang phát triển (Shimada, 1999). Ghép ESC trong dâu có thể tạo ra những con chuột khả thi, cơ thể trong đó bao gồm duy nhất của hậu duệ tặng ESC, mà mở ra cơ hội cho một loạt các tùy chọn sao chép điều trị. Bây giờ là một phương pháp tiếp cận như vậy đã được áp dụng thành công để nghiên cứu các vấn đề của sinh học phát triển, đặc biệt, nó có thể phân tích các cơ chế di truyền của bất hoạt của nhiễm sắc thể X hoặc không ổn định biểu sinh của hESCs. Cấy ghép ESC vào phôi giai đoạn sớm cũng được sử dụng trong công nghệ sinh học trong nông nghiệp, cũng như trong các thí nghiệm về liệu pháp gen.

Cấy ghép các ESC biến đổi gen được sử dụng để kiểm tra các tế bào đích của gen đột biến. Cấy in vitro ECS được sử dụng trong công nghệ sinh học để tạo ra chuột knockout. Với mục đích này, bởi sự tái tổ hợp tương đồng để được gỡ bỏ từ gen nghiên cứu ESCs (knock-out) và môi trường chọn lọc các tế bào tiết ra thiếu gen này. Sau đó các loại ESC loại trực tiếp được tiêm vào phôi nang hoặc kết hợp với blastomeres của morula. Các phôi sớm khảm do đó thu được cấy vào một phụ nữ người nhận và chuột sơ sinh được lựa chọn giữa các cá nhân với giao tử, nullizigotnymi của gen này. Với công nghệ này, nhiều con chuột knockout đã được tạo ra, được sử dụng rộng rãi trong sinh học thực nghiệm và y học thực nghiệm. Tại các mô hình sinh học đã nghiên cứu giá trị của gen nhất định trong phát triển phôi, cũng như vai trò của họ trong các cơ chế của bệnh và tình trạng bệnh lý ở người. Ngoài ra, các dòng của động vật loại trực tiếp được sử dụng trong giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng của các phương pháp điều trị gen mới. Ví dụ, bằng cách sử dụng thâm chuyển gen trong ESK alen bình thường của gen đột biến quản lý hiệu quả điều chỉnh đột biến, tấn công hệ thống hemopoietic. Giới thiệu các gen ngoại lai vào ESC cho phép tạo ra các dòng của các động vật thí nghiệm biến đổi gen đồng hợp với tốc độ nhanh. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng việc xóa gen tái tổ hợp kỹ thuật của đạo đáng tin cậy làm việc ra như được nêu ra chỉ tương đối ESC chuột. Sử dụng chuột ESCs đôi loại trực tiếp cài đặt chức năng cụm vai trò tích gen trên NST số 7 (bản sao khu vực di truyền nhiễm sắc thể 19 phút của con người), và phần đầu gần của nhiễm sắc thể 11 (sao chép nhiễm sắc thể 5d con người) - xóa các gen trong Chuột ESK đã cho phép đánh giá chức năng của các chất tương tự của chúng trên người.

Các nghiên cứu chức năng công suất gen phôi người, thâm chuyển trong gen mà động vật trong phòng thí nghiệm cho phép hESCs trong crypto đặc biệt làm rõ vai trò của gen trong tab và hình thành các gen trung bì tim, pax-6 - trong mắt phôi. Tạo nên sự biểu hiện đầu tiên của gen trong non nớt thẻ sinh sản ESC teratocarcinoma và chuột túi phôi khẳng định đàn áp tràn ngập trong gen transsignalizatsii ESK. Sự kết hợp của ESCs đột biến 60-80 và 20-30 tế bào của phôi chuột trước cấy bình thường dẫn đến sự phát triển của phôi khảm trong đó có thể đánh dấu các cơ quan được tạo thành từ các tế bào hiến và người nhận, cho phép chúng ta xác định vai trò của gen lạ trong gastrulation và cơ quan. Bản đồ chức năng của gen phát triển phôi chuột chi tiết mở rộng về vai trò của gen sf-1 tab trong tuyến thượng thận và sơ khởi sinh dục, wt-1 gen - trong thận gen gia đình tab myoD - trong tab của gia đình gen cơ xương gata-1-4 - trong sự trưởng thành giới hạn cơ sở của hồng ban và bạch huyết.

Đạo tắt của alen của cha mẹ của các gen trong hESCs sử dụng recombinase vector phục vụ để làm rõ các chức năng của các gen khác nhau trong phôi sớm và công nghệ nhắm mục tiêu của gen lạ của con người trong ESCs chuột góp phần vào việc phát hiện các gen đột biến mới chịu trách nhiệm về sự phát triển của bệnh di truyền nghiêm trọng. Sử dụng phương pháp loại trực tiếp được xác định tầm quan trọng bắt buộc của một số gen cho việc bố trí các mô phôi: gata-4 - đối với nhồi máu, gata-1 - để hồng cầu hemopoietic mô, myoD - cơ xương, brachyury - cho hạn chế trung bì transcriptases hnf3 và hnf4 - cho tế bào gốc gan, rag-2 - bookmark cho nhái của T và tế bào lympho B (Repin, 2001). Xóa đôi của gen trong hESCs đã mở quyền truy cập vào các nghiên cứu về vai trò chức năng của các gen của các lớp mầm, phân khúc và homeosis và ESC cấy ghép cho khả năng lấy phôi lai khác loài khả thi. Với phương pháp cải tiến ghép PGCs nhà tài trợ trong một phôi 8 tế bào đơn chứng minh chimerization rằng ở cấp độ tế bào của nhiều cơ quan của phôi thai người nhận. Lưu ý rằng mầm tế bào được tìm thấy trong các mô cơ quan nhận con chuột con người sau khi tiêm tế bào gốc tạo máu của con người vào một túi phôi. Người ta thấy rằng trong phôi chuột trong sự hình thành của các cơ quan tuần hoàn máu hESCs đa năng. Có thể là chức năng sinh học của họ là tổ chức của hệ thống miễn dịch của thai nhi trong tương lai. Với ESC in vitro sao chép mô hình đầy đủ của bệnh di truyền ở người: mô hình loại trực tiếp gen dystrophin đôi ở chuột của bệnh teo cơ Duchenne, gen tắt máy atm (điều khiển tín hiệu tổng hợp kinase chromatin) - mất điều hòa-teleangektaziyu. Trong trường hợp này, một căn bệnh di truyền gây tử vong ở trẻ em do khiếm khuyết trong sửa chữa DNA phát triển thoái hóa của các tế bào Purkinje ở tiểu não, được kèm theo một sự co hồi của tuyến ức do cái chết của các tế bào sinh sản. Clinic, sinh lý bệnh và patomorfologija tazii mất điều hòa-teleangek- sao chép qua việc đưa vào các thông tin di truyền bất thường ESC từ Chimeras chuột tương ứng với những ở người. Hơn nữa mất điều hòa-teleangektazii sử dụng PGCs và chuột knockout phát triển mô hình thực nghiệm, một số bệnh nhân đồng hợp tử di truyền liên quan đến rối loạn carbohydrate và chuyển hóa lipid, dị hóa của các axit amin, loại bỏ đồng và bilirubin, trong đó tăng đáng kể khả năng của y học thực nghiệm để thử nghiệm tiền lâm sàng của phương pháp mới để điều trị các bệnh liên quan quyền.

[16], [17], [18], [19], [20]

Việc sử dụng tế bào gốc cytohybrid

Các tế bào lai thu được bằng cách nung chảy các tế bào soma từ hESCs, là mô hình thích hợp và đầy hứa hẹn cho học pluripotency tế bào gốc và tái lập trình các tế bào nhiễm sắc thể phân biệt. Tsitogibridy thu được bằng việc sáp nhập của ESC với các tế bào khác biệt của con vật trưởng thành, cung cấp một cơ hội để nghiên cứu mối quan hệ giữa bộ gen của "lứa tuổi" khác nhau: phát triển một tình huống độc đáo nơi các nhiễm sắc thể tương đồng có nguồn gốc từ các tế bào của giai đoạn khác nhau của sự khác biệt, và mức độ trưởng thành khác nhau, là trong nhân giống, nơi họ có thể dễ dàng transdeystvuyuschimi chia sẻ tín hiệu quy định. Rất khó để dự đoán như thế nào sẽ phản ứng tsisregulyatornye hệ thống biểu sinh của nhiễm sắc thể tương đồng hiện trong yn phát triển phân biệt, để đáp ứng với các tín hiệu tác động transdeystvuyuschih từ bộ gen có liên quan phôi thai. Hơn nữa, trong các tế bào lai xảy ra sự phân chia của nhiễm sắc thể của cha mẹ cho phép để nghiên cứu sự tương tác của các gen ở cấp độ nhiễm sắc thể riêng biệt, ví dụ, có khả năng xác định một phần của nhiễm sắc thể cụ thể trong việc duy trì pluripotency, hoặc trái lại, một đầu ra khác biệt.

Là mô hình thí nghiệm đầu tiên để nghiên cứu sự tương tác của các bộ gen với "lịch sử phát triển" khác nhau, các cytohybrids thu được bằng sự kết hợp của khối u ác tính đa năng và các tế bào soma khác biệt đã được sử dụng. Trong một số trường hợp, những tế bào lai như vậy vẫn giữ được các thuộc tính đa năng ở mức độ cao. Đặc biệt, tế bào soma trong tế bào soma ở vivo tạo ra sự phát triển các u ác tính thực sự có chứa các dẫn xuất của cả ba màng tế bào, và các mẫu phôi in vitro đã được hình thành trong các môi trường huyền phù. Ngay cả trong kiểu này giữa các loài tsitogibridov ghi nhận sự hiện diện của kháng nguyên của thai nhi trong trường hợp đối tác soma trong việc sáp nhập với các tế bào teratocarcinoma là tế bào lympho hoặc thymocytes. Đáng chú ý là các tế bào lai tạo ra bởi sự kết hợp của các tế bào ung thư da với tế bào nguyên bào sợi tương ứng với nguyên bào sợi theo kiểu hình.

Điều quan trọng nhất là một thực tế chứng minh rằng trong teratokartsinomno tế bào lai soma xuất hiện dấu hiệu gen tái lập trình các tế bào phân biệt, đặc trưng bởi một sự tái hoạt của gen cá nhân hoặc không hoạt động X-chromosome đối tác soma. Như vậy, kết quả nghiên cứu trên các tế bào teratokartsinomno-soma loại tsitogibridah chỉ ra rằng các tế bào lai thường giữ lại pluripotency và tái lập trình của bộ gen, có những dấu hiệu của đối tác soma.

Trong các thí nghiệm để có được phôi tế bào lai trong một loài bằng cách nung chảy splenocytes với động vật ESCs chuột trưởng thành được nghiên cứu đặc điểm tsitogibridov như vậy, phân tích sự phân chia của nhiễm sắc thể của cha mẹ và đánh giá bộ gen pluripotency lai. Đối với các tế bào lai khác loài được sản xuất bởi các tế bào teratocarcinoma hợp với các tế bào soma, thường được đặc trưng bởi sự phân biệt thấp của nhiễm sắc thể với karyotype tứ bội hoặc gần tứ bội. Một thành phần nhiễm sắc thể tương tự được quan sát thấy trong cytohybrid bằng sự kết hợp của các tế bào sinh dục chính với lympho bào. Cùng lúc đó, các tế bào lai khác loài thu được là kết quả của việc sáp nhập của chuột tế bào lympho tế bào teratokartsinomnyh chồn, đã có sự phân biệt dữ dội của nhiễm sắc thể đối tác soma.

Một giai đoạn mới về chất trong việc nghiên cứu sự phân chia của nhiễm sắc thể của cha mẹ trong lai khác loài được đưa ra sau sự phát triển của phương pháp phân tích microsatellite bằng cách sử dụng phương pháp PCR, mà mỗi nhiễm sắc thể chuột tìm thấy một vài trăm dấu, cho phép tin cậy phân biệt đối xử giữa bất kỳ cặp nhiễm sắc thể tương đồng trong các tế bào lai.

Bằng cách kết hợp ESK (sử dụng tế bào HM-1 thiếu trong hoạt động gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, tách biệt khỏi sự căng thẳng phôi nang chuột 129 / 01a) với splenocytes từ chuột congenic dòng DD / c thất bại trong việc nhận các thiết lập của máy nhái lai hình thái có sự tương đồng với hESCs. Tất cả các dòng vô tính đã được phân lập trên môi trường chọn lọc, trong đó tốc độ tăng trưởng có thể chỉ với các gipoksantinfosforiboziltransferazoy tế bào hoạt động. Phân tích điện di cho thấy sự hiện diện của tất cả các máy nhái alen biến gipoksantinfosforiboziltransferazy đặc chuột DD / c. Sử dụng phân tích di truyền tế bào, nó đã được tìm thấy rằng bốn có ba nhái lai okolodiploidny bộ nhiễm sắc thể. Một gần tứ bội bản sao chứa hai quần thể của các tế bào lai, một trong số đó là tứ bội, và thứ hai, nhỏ hơn - lưỡng bội.

Phân tích microsatellite cho phép phân biệt bất kỳ cặp nhiễm sắc thể tương đồng chuột 129 / 01a và DD / c, trong các dòng vô tính lai với thiết lập okolodiploidnym cho thấy nhái xảy ra trong hai biệt loại bỏ ưu đãi đối tác soma NST thường. Hầu hết các máy nhái NST thường HESS2 và HESS3 đã đánh dấu dòng 129 / 01a, tức là, đối tác đa năng. Trường hợp ngoại lệ là nhiễm sắc thể 1 và I: nhái HESS2 và HESS3, cùng với các dấu hiệu của các tế bào HM-1, một số ít các dấu hiệu hiện tại đối tác soma. Các kết quả này có thể phản ánh sự phân biệt không đầy đủ của nhiễm sắc thể 1 và và đối tác soma và phù hợp với dữ liệu di truyền tế bào mà trisomy của nhiễm sắc thể xảy ra ở 30-40% HESS2 và các dòng tế bào HESS3. HESS4 bản sao khác biệt đáng kể trong thành phần nhiễm sắc thể: nhiều NST thường bản sao này có nguồn gốc từ bộ gen ESK (nhiễm sắc thể 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 và 17), nhưng nhiễm sắc thể 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 và 19 đã được trình bày đồng đẳng của cả cha lẫn mẹ. Tỷ lệ định lượng của microsatellite markers những nhiễm sắc thể tương đồng tương ứng xấp xỉ 1: 1. Điều này cho phép các tác giả gợi ý rằng một homolog có nguồn gốc từ bộ gen của ESC và người kia - từ các tế bào phân biệt. Trong một số subclones của bản sao HESS4 quan sát chỉ hiện diện dấu hiệu của nhiễm sắc thể 18 và 19 đối tác soma. Kết quả cho thấy các tế bào sao chép HESS4, ngoài việc cách ly các nhiễm sắc thể đối tác soma, đã có việc loại bỏ một hoặc cả hai đồng đẳng của bộ gen đa năng nhiễm sắc thể ở trên, tức là, có một sự phân biệt hai mặt của nhiễm sắc thể của cả cha lẫn mẹ - hiện tượng này là khá bất thường, vì tsitogibridov phân biệt đặc trưng của nhiễm sắc thể chỉ một trong những bậc cha mẹ.

Bên cạnh đó, sau khi thông qua 20, tất cả các máy nhái của tế bào lai chỉ chứa dấu X nhiễm sắc thể của đối tác soma, có nghĩa là, trong các dòng vô tính đã được thay thế X nhiễm sắc thể ESC trên nhiễm sắc thể X của đối tác soma. Điều này được khẳng định bằng dữ liệu lai ghép tại chỗ bằng cách sử dụng đầu dò có nhãn FITC cụ thể cho nhiễm sắc thể X của chuột: tín hiệu dương được phát hiện trên một nhiễm sắc thể. Cần lưu ý rằng ở các giai đoạn trước đây của canh tác (đến đoạn thứ 15), theo số liệu tế bào học, ở nhiều tế bào có hai nhiễm sắc thể X. Do đó, việc sử dụng phương tiện chọn lọc có thể điều khiển thành phần nhiễm sắc thể của tế bào lai và chọn lọc các dòng vô tính mang các nhiễm sắc thể đơn của đối tác soma so với nền của bộ gen ESC.

Như một tính năng độc đáo của tsitogibridov gen là nội địa hóa của bộ gen của cha mẹ trong một lõi duy nhất, tất nhiên, đặt ra câu hỏi của việc duy trì các tính chất của gen phôi lai tế bào ESC-soma đa năng trong điều kiện tiếp xúc chặt chẽ với các bộ gen của các tế bào phân biệt. Về mặt hình thái, cytohybrid của ESC và các tế bào soma tương tự như dòng bố mẹ của ESC. Trình độ chuyên môn pluripotency cho thấy rằng tất cả các máy nhái okolodiploidnym bộ nhiễm sắc thể có thể hình thành trong nền văn hóa hệ thống treo của cơ quan embryoid trong đó các dẫn xuất của ba lớp mầm hiện nay.

Hầu hết các tế bào lai có chứa kháng nguyên ECMA-7, một điểm đặc trưng của phôi chuột đầu và cũng có hoạt tính phosphatase kiềm cao. Dữ liệu thuyết phục nhất về tính chất đa năng cao của tế bào lai đã thu được trong các thí nghiệm để thu được một loạt các chimeras tiêm chích các tế bào lai của clone HESS2. Một phân tích các dấu hiệu sinh hóa cho thấy các hậu duệ của các tế bào lai của các nhà tài trợ đã được tìm thấy trong hầu hết các mô chimra. Do đó, các tế bào lai thu được bằng sự kết hợp của tế bào ESC và tế bào phân biệt somatic giữ lại sự phát triển ở mức cao, bao gồm khả năng tạo ra các loài chimeras khi đưa vào khoang phôi nang.

Các dòng vô tính HESS2 và HESS4 khác biệt đáng kể trong thành phần của nhiễm sắc thể mẹ, nhưng chúng có các đặc tính đa năng tương tự nhau. Người ta có thể tin rằng tính đa năng trong hệ gen lai biểu hiện chính nó như là một tính năng chi phối, nhưng có thể là không phải tất cả các nhiễm sắc thể của bộ gen phôi thai đều tham gia vào quá trình duy trì tính đa năng. Nếu giả thuyết này là chính xác, người ta có thể hy vọng rằng việc loại bỏ một số nhiễm sắc thể của đối tác đa năng từ bộ gen lai sẽ không kèm theo sự thay đổi về vị thế đa năng của họ. Trong trường hợp này, phân tích phân tách nhiễm sắc thể mẹ trong tế bào lai phôi sẽ cho phép tiếp cận gần với việc xác định các nhiễm sắc thể có nhiệm vụ kiểm soát tính đa năng của tế bào phôi.

Serov O. Et al (2001) tìm thấy trong số 50 con thu được từ thánh giá của Chimeras với những con chuột bình thường, những người mà sẽ có những con chuột kiểu gen 129 / 01a, và mang nhiễm sắc thể X DD chuột. Các tác giả thấy lý do của việc này trong việc giảm tính đa năng trong các tế bào lai dưới ảnh hưởng của bộ gen soma. Một giải thích khác có thể là ảnh hưởng tiêu cực của trisomy đối với một số autosomes và sự mất cân bằng trong nhiễm sắc thể giới tính (XXY được quan sát thấy trong tế bào trước đoạn thứ 15) trong tế bào lai khi chúng truyền qua meiosis. Được biết rằng các tế bào của XXY không thể đi qua phân bào và hình thành các giao tử. Trisomy cũng có thể làm giảm hoạt động sinh sản của tế bào lai, do đó ưu thế chọn lọc trong sự phát triển của chimeras có thể thuộc về các tế bào của phôi người nhận. Sau đó, để đánh giá đầy đủ tiềm năng đa năng của tế bào lai, cần phải có các nhân bản lai với một bộ các nhiễm sắc thể thông thường.

Trong các thí nghiệm Serova O. Et al (2001) lần đầu tiên đã chứng minh khả năng tái lập trình các nhiễm sắc thể X trong bộ gen của một tế bào tế bào lai soma. Kết luận này sau từ các tác giả phân tích sự biểu hiện của Chimeras gen hprt (X-chromosome marker): sự hiện diện của alen biến thể hprt DD / c chuột đã được phát hiện trong tất cả các mô phân tích khảm. Cần nhấn mạnh rằng sau khi sự ra đời của các tế bào lai trong khoang phôi nang tsitogibridy rơi vào tình trạng không có chọn lọc và bảo quản của nhiễm sắc thể X trong bộ gen của các tế bào lai có nghĩa là nó đã trở thành một thành phần bắt buộc của bộ gen của nó và không phân biệt đối xử nó từ các đối tác nhiễm sắc thể pluripotent Y.

Tóm tắt các kết quả phân tích của sự tương tác của gen phôi soma và đa năng trong các tế bào lai, các tác giả kết luận rằng, trong pluripotency tsitogibridah nhất định xuất hiện như một đặc điểm nổi trội. Gen lai có khả năng nhiễm sắc thể cá nhân lập trình lại các tế bào khác biệt, trong đó, tuy nhiên, không loại trừ các hiệu ứng ngược trên pluripotency gen soma của gen phôi. Trong quá trình lai tạo các tế bào lai, sự tạo ra sự phân biệt xảy ra thường xuyên hơn nhiều so với dòng gốc của ESC NM-1. Một tác dụng tương tự được quan sát trong sự hình thành của thuộc địa chính: nhiều thuộc địa chủ yếu của tế bào lai phôi biệt trong giai đoạn đầu của giáo dục với sự mất mát to lớn của máy nhái trong chăn nuôi và sinh sản của họ.

Như vậy, tsitogibridy bởi sự sát nhập của ESC với các tế bào soma, bất chấp sự tiếp xúc gần gũi với bộ gen của tế bào phân biệt giữ pluripotency như một tính năng độc đáo của bộ gen của phôi. Hơn nữa, trong các tế bào lai, có thể lập trình lại các nhiễm sắc thể riêng lẻ có nguồn gốc từ các tế bào khuếch tán. Nó vẫn còn chưa rõ ràng như thế nào cũng được bảo tồn tính ripotentnye plyu- bộ gen của phôi trong các tế bào lai, đặc biệt là khả năng của mình để tham gia vào sự hình thành của Chimeras mầm-line. Đối với điều này, nó là cần thiết để có được tế bào lai phôi với một karyotype bình thường. Trong mọi trường hợp, các tế bào lai phôi đa năng có thể là một mô hình thực sự cho việc xác định di truyền của nhiễm sắc thể tham gia vào việc duy trì pluripotency hoặc kiểm soát của mình như phân biệt song phương của nhiễm sắc thể của cha mẹ có khả năng cung cấp như một cơ hội.

Không kém hấp dẫn là nghiên cứu về hiện tượng này, mà O. Serov và các đồng tác giả (2001) định nghĩa là "trí nhớ nhiễm sắc thể". Trong bộ gen lai nhiễm sắc thể tương đồng là hai cấu hình thay thế: tương đồng soma đối tác một lần trải qua những sự khác biệt, trong khi đồng đẳng đối tác đa năng, quá trình này chỉ mới bắt đầu. Do đó, việc duy trì tính đa năng cao của các tế bào lai chỉ ra rằng "đa năng" tương đồng cấu hình ESC khá ổn định trong bộ gen lai, bất chấp những tác động của các yếu tố transdeystvuyuschih phát ra từ các đối tác soma. Các tính năng được mô tả ở trên của tái lập trình phân biệt nhiễm sắc thể gen tương đồng trong quá trình phát triển của Chimeras không loại trừ khả năng rằng các giai đoạn đầu tiên của sự hình thành in vitro và nuôi cấy tsitogibridov họ duy trì tình trạng của họ có được trong sự khác biệt trong cơ thể. Theo số liệu gần đây, khi chuyển các tế bào lai phôi trong môi trường không chọn lọc, trong đó có một nhiễm sắc thể loại bỏ chỉ đối tác soma chuyên sâu, ví dụ: bộ gen của tế bào lai dễ dàng phân biệt đối xử đồng đẳng sau khi nuôi cấy in vitro từ 10-15 đoạn. Do đó, các tế bào lai phôi đại diện cho một mô hình thực nghiệm đầy hứa hẹn cho việc nghiên cứu không chỉ của các thuộc tính cơ bản của gen phôi như pluripotency, mà còn lựa chọn thay thế của nó - sự khác biệt phôi.

Hiệu quả điều trị của việc cấy ghép tế bào gốc phôi

Trước khi phân tích hiệu quả điều trị của cấy ghép ESC và các dẫn xuất của chúng, chúng tôi tóm tắt các tài liệu trên. Tính năng ESC về việc thực hiện đầy đủ các phôi trong ống nghiệm là không đủ vì các khiếm khuyết trong trường hợp này do sự vắng mặt của các tế bào gốc trung mô xảy ra trong cơ thể tự chủ và độc lập từ hESCs. Hiệu lực gen của ESC ít hơn tiềm năng di truyền của zygote, do đó nó không được trực tiếp sử dụng để nhân bản phôi. Tiềm năng sinh học duy nhất của ESC là các tế bào duy nhất, trong đó các chương trình phát triển được triển khai toàn bộ, được tìm thấy trong các nghiên cứu về chức năng của gien. Với sự trợ giúp của ESC, sự kết hợp đầu tiên của các tín hiệu kích hoạt sự biểu hiện của gen sớm và muộn mã hóa sự phát triển của ba phôi thai được giải mã. Bảo tồn gen pluripotency của ESCs in vitro làm cho họ công cụ duy nhất để tái tạo sửa chữa có thể tự động bù đắp cho thiệt hại tế bào bị hư hỏng bộ phận cơ thể và các mô. Trong một thân giả thuyết lý tưởng có thể giả định rằng "... Trong việc cấy ghép PGCs nhà tài trợ trong cơ thể người nhận sẽ được chuyển chương trình đóng gói gọn rằng dưới điều kiện thuận lợi được thực hiện trong việc xây dựng các tkani'7 mới có khả năng" ... Tích hợp một cách hiệu quả vào cơ thể của người nhận như hình thái, cả chức năng và chức năng. "

Đương nhiên, sau sự phát triển của các phương pháp cho sự phân tách đơn độc của ESC, nghiên cứu in vivo về hoạt động chức năng của tế bào thu được trong ống nghiệm từ một nhân bản chuyên biệt đã bắt đầu. Các nhân ESO sinh sôi nảy nở tạo ra các quần thể tế bào gốc di chuyển thực sự có khả năng tích cực tích hợp vào các vùng tổn thương mô của người nhận, được sử dụng trong y học tái tạo-nhựa. Nó đã được xác định rằng việc cấy ghép Dopa-neurons trong substantia nigra làm giảm các biểu hiện lâm sàng trong điều trị bệnh hemiparkinson. Ghép tế bào gốc thần kinh trong khu vực làm giảm mức độ rối loạn động cơ do chấn thương hoặc tê tuỷ và não. Nhận được và kết quả dương tính đầu tiên của việc cấy ghép tế bào gốc trong các bệnh demyelin. Có vẻ như sức mạnh tái tạo nhựa của ESCs mở ra khả năng không giới hạn cho việc sử dụng cấy ghép tế bào trong y học thực tế. Tuy nhiên, khi cấy vào vùng ectopic, ESCs chắc chắn sẽ biến đổi thành khối u. Khi chích dưới da của ESC ở chuột bị dị tật u ác tính được hình thành. Khi hệ thống treo ESK được cấy ghép dưới lòng nang của tinh hoàn trong chuột gây loạn thần, một khối u cũng được hình thành, bao gồm các mô khác nhau, các tế bào của chúng được bắt nguồn từ cả ba phôi thai. Trong các khối u da như vậy, các quá trình giảm sinh thể là rất hiếm.

Một số tác phẩm cung cấp thông tin về những kết quả tích cực của việc cấy ghép các dẫn xuất sớm của ESCO cho động vật với một bệnh lý ngoại sinh. Tế bào ghép neuron sử dụng các dẫn xuất của PGCs là tiếp tục phát triển trong thí nghiệm và thử nghiệm lâm sàng đầu tiên trên chỉnh các rối loạn chức năng trong não và chấn thương tủy sống, điều trị syringomyelia và bệnh đa xơ cứng (Repin, 2001). Với sự ra đời của ESCs neyronogeneza công nghệ in vitro, thay vì sử dụng kỹ thuật cấy mô não phôi dẫn xuất của neurospheres, thu được từ nuôi cấy mô thần kinh phôi phát triển. Những sự đình hoãn cấy ghép như vậy là đồng nhất hơn nhiều và có chứa tiền chất thần kinh và thần kinh.

Ngoài môi trường nuôi cấy thường xuyên với acid retinoic ở liều 10 ug / ml trong vòng 6 tuần trong dòng phôi (u quái) NTERA-2 -kartsinomy con người được hình thành trên 80% số tế bào thần kinh sau phân bào. Tính đồng nhất hoàn toàn của dân số tế bào thần kinh được thực hiện bằng dòng chảy sắp xếp dấu immunophenotypic dán nhãn của tế bào thần kinh trưởng thành có thể thoát khỏi những tàn dư teratokartsinomnyh và các tế bào chưa trưởng thành. Sau khi cấy ghép vào các vùng khác nhau của não động vật thí nghiệm, các tế bào thần kinh không chỉ tồn tại, mà còn được xây dựng trong mạng lưới thần kinh khu vực. Ở động vật với các mô hình thực nghiệm của các khuyết tật địa phương CNS ghép neuron làm giảm biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân như những ảnh hưởng của chấn thương craniocerebral, đột quỵ, bệnh demyelinating, khuyết tật phát triển tiểu não di truyền, bệnh lắng đọng lipid và polysaccharides.

Để tối ưu hóa các quá trình tái tạo trong các bệnh thoái hóa của hệ thống thần kinh trung ương, các công nghệ để chế tạo các oligodendrocytes sản xuất myelin từ ESK đang được phát triển. Giai đoạn đầu tiên theo truyền thống liên quan đến sự gia tăng của ESCs với sự nhân lên của số lượng tế bào cần thiết cho việc cấy ghép. Trong giai đoạn thứ hai, sự khác biệt trực tiếp của các tế bào vào một quần thể các tiền thân oligodendrocyte tạo ra myelin được thực hiện, được kiểm soát bởi các kháng nguyên marker chọn lọc.

Một số triển vọng được mở ra cho các dẫn xuất sử dụng ESCs để phát triển các phương pháp sửa chữa suy giảm miễn dịch do các khiếm khuyết di truyền trong sự trưởng thành của tuyến ức. Trong các nghiên cứu trong loại trực tiếp (rag 1) chuột với khiếm khuyết gen gây ra - vi phạm cơ chế tái tổ hợp V (D) gen J locus TCR, dẫn đến mất chức năng của T-lymphocyte, cấy ghép các dẫn xuất sớm PGCs trong tuyến ức động vật phục hồi trưởng thành của người dân bình thường bắt chước miễn dịch chịu trách nhiệm về miễn dịch tế bào. Các thử nghiệm lâm sàng của cấy ghép preformed trong hESCs vitro để điều trị bệnh thiếu máu di truyền gây tử vong ở trẻ em.

Sự phản đối việc đưa nhanh sự cấy ghép tế bào gốc vào phòng khám được chứng minh bằng một số lượng hạn chế các dòng ổn định của tế bào gốc phôi người và nhu cầu tiêu chuẩn hóa của chúng. Để tăng độ tinh khiết của dòng ESC tiêu chuẩn và các tế bào gốc trưởng thành được đề nghị sử dụng một phương pháp để lựa chọn dòng trên cơ sở các phân tích di truyền phân tử của DNA lặp song song ngắn. Cần thiết cũng sẽ được kiểm tra dòng ESC cho sự hiện diện của quang sai nhiễm sắc thể nhỏ và đột biến gen, tiềm năng cho sự xuất hiện của mà trong điều kiện nuôi cấy tế bào là khá lớn. Luận án kéo dài bắt buộc thử nghiệm các tính chất của tất cả các loại PGCs và các tế bào gốc đa năng trong khu vực, kể từ khi tuyên truyền của họ trong ống nghiệm có thể làm phát sinh đặc điểm mới không vốn có trong các tế bào gốc phôi thai để dứt khoát hoặc mô. Đặc biệt, người ta cho rằng canh tác lâu dài trong môi trường với các cytokine Hess gần gũi hơn với các tế bào ung thư, vì chúng xảy ra con đường thay đổi tương tự điều tiết chu kỳ tế bào với việc mua lại khả năng để thực hiện một số không giới hạn của phân chia tế bào. Một số tác giả, dựa trên cơ sở tiềm năng phát triển khối u, xem xét việc cấy ghép các dẫn chất ban đầu của tế bào gốc phôi như là sự thiếu thận trọng. Theo họ, an toàn hơn là sử dụng các con cháu cam kết của ESC, nghĩa là các dòng của các tổ tiên của các tế bào phân biệt. Tuy nhiên, một kỹ thuật đáng tin cậy để có được dòng tế bào ổn định của con người mà phân biệt theo đúng hướng vẫn chưa được phát triển.

Vì vậy, trong văn học ngày càng có nhiều dữ liệu về hiệu quả điều trị tích cực của việc cấy ghép các dẫn chất của tế bào gốc phôi người. Tuy nhiên, nhiều tác phẩm này phải được sửa đổi và phê bình. Một số nhà nghiên cứu tin rằng kết quả của các thử nghiệm lâm sàng sớm có tính chất sơ bộ và chỉ cho thấy rằng các tế bào gốc có thể có tác dụng có lợi trên lâm sàng của bệnh. Vì vậy, cần phải có được dữ liệu về kết quả lâu dài của việc cấy ghép tế bào. Như là một lập luận, các giai đoạn phát triển của neurotransplantology lâm sàng được đưa ra. Trên thực tế, trong các tài liệu, ban đầu bị chi phối bởi việc công bố hiệu quả cao của các ca cấy ghép não mảnh vỡ của phôi trong bệnh Parkinson, nhưng sau đó bắt đầu xuất hiện các báo cáo phủ nhận hiệu quả điều trị của mô thần kinh phôi hoặc thai cấy vào não của bệnh nhân.

Tiến hành các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên đánh giá sự an toàn của cấy ghép neuroblast - dẫn xuất của PGCs NTERA-2 teratocarcinoma, các tế bào chưa trưởng thành mà sinh sôi nảy nở trong văn hóa đã phải chịu lưu trữ 100 triệu khối tế bào. Một phần của tế bào do đó-thu được đã được sử dụng để xác định các đặc điểm của kiểu hình tế bào và các tạp chất, cũng như để kiểm tra ô nhiễm tiềm tàng do virus và vi khuẩn. Từ môi trường nuôi cấy đã được gỡ bỏ LIF và lớp trung chuyển của các tế bào mô đệm và điều kiện tạo ra thai nhi ở các biệt đạo diễn của hESCs vào neuroblasts với sự kết hợp của các cytokine và các yếu tố tăng trưởng. Sau đó, các bộ lọc thần kinh được tinh chế từ các tế bào ung thư biểu mô u sót không đều trên một máy so sánh lồng nuôi. Sau khi thanh lọc thứ hai và đặc tính của các kiểu hình của các tế bào neuroblasts cấy (10-12 triệu) đình chỉ sử dụng một ống tiêm và microcannulas stereotaxy đặc biệt và thuộc thẩm quyền của CT tiêm vào basalis hạt nhân của bộ não của bệnh nhân (tháng thứ bảy sau khi đột quỵ xuất huyết). Sau cấy ghép một năm kiểm tra các tác động của việc cấy ghép thần kinh trong vùng đột qu showed cho thấy không có tác dụng phụ và tác dụng không mong muốn. Một nửa số bệnh nhân có sự cải thiện chức năng vận động trong giai đoạn từ 6 đến 12 tháng sau khi cấy ghép. Thay đổi lâm sàng tích cực đã được kèm theo sự gia tăng trong khu vực đột quỵ cung cấp máu sau khi cấy ghép các tế bào: có nghĩa là tăng sự hấp thụ của 2-deoxyglucose gắn huỳnh quang, theo positron emission tomography đạt 18%, và trong một số bệnh nhân - 35%.

Tuy nhiên, Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ đã tiến hành một nghiên cứu độc lập về hiệu quả lâm sàng của việc cấy ghép thần kinh ở bệnh nhân Parkinson. Bệnh nhân trong nhóm đầu tiên được cấy ghép với mô thần kinh phôi sản xuất dopamine, trong khi nhóm thứ hai của bệnh nhân đã trải qua một hoạt động sai. Kết quả cho thấy không có hiệu quả lâm sàng của việc cấy ghép thần kinh như vậy, mặc dù các nơ-ron phôi thai sản sinh ra dopamine sống sót trong não của người nhận. Hơn nữa, sau 2 năm sau khi cấy mô thần kinh của thai nhi trong 15% bệnh nhân phát triển rối loạn vận động bền bỉ, mà là vắng mặt ở những bệnh nhân trong nhóm giả dược (Tế bào gốc: tiến bộ khoa học và phương hướng nghiên cứu trong tương lai Nat Inst, Y tế Hoa Kỳ ...). Các quan sát về sự phát triển của bệnh ở những bệnh nhân này tiếp tục.

Một số tác giả thuộc tính tài liệu mâu thuẫn nhau về đánh giá các dữ liệu hiệu quả ghép neuron lâm sàng với một cách tiếp cận khác nhau để lựa chọn các nhóm bệnh nhân, sự lựa chọn đầy đủ các phương pháp khách quan để đánh giá tình trạng của họ và quan trọng nhất, các điều khoản khác nhau của sự phát triển của các mô thần kinh của thai nhi và trong các phần khác nhau của não bộ từ đó vải được sản xuất trong các kích cỡ khác nhau cấy ghép và các tính năng phương pháp phẫu thuật.

Cần lưu ý rằng nỗ lực để chỉ đạo cấy ghép các tế bào gốc phôi đa năng trong khu vực thể vân của não bộ của chuột với gemiparkinsonizmom cơ thể nghiệm kèm ESC tăng sinh và biệt của họ vào tế bào thần kinh dopaminergic. Nó phải được giả định rằng các tế bào thần kinh mới được thành lập một cách hiệu quả được xây dựng vào mạng nơron như ESCs sau khi cấy ghép đã được quan sát sửa chữa bất thường về hành vi và đối xứng cơ trong thử nghiệm apomorphine. Đồng thời, một số động vật chết do chuyển đổi ESK cấy ghép trong khối u não.

Các chuyên gia của Học viện quốc gia và y tế Mỹ, các chuyên gia của National Institutes of Health tin rằng tiềm năng lâm sàng của hESCs đáng chú ý nghiêm trọng, tuy nhiên, nhấn mạnh vào sự cần thiết của một nghiên cứu chi tiết về tài sản của họ, khả năng xảy ra biến chứng và ảnh hưởng lâu dài trong các thí nghiệm với các mô hình sinh học đầy đủ của bệnh nhân (Tế bào gốc và thuốc tái tạo trong tương lai Học viện Báo chí Quốc gia, Tế bào gốc và các hướng nghiên cứu trong tương lai, Nat. Inst, Health USA).

Từ quan điểm này điều quan trọng là việc phân tích mô học so sánh của u quái thực nghiệm thu được bằng cách cấy ghép trong PGCs bùn tinh hoàn với u quái mà tôi đã phát triển do cấy phôi sớm, trong đó bao gồm cũng có mặt ESC cho thấy ESK không phân biệt xuất xứ hoặc tương tác của chúng với bởi những tế bào xung quanh hoặc trong cùng một cách nhận ra sức mạnh khối u của chúng. Nó chứng minh rằng u quái như vậy có nguồn gốc vô tính, như từ một ESCs khối u có thể xảy ra, bao gồm các dẫn xuất của cả ba lớp mầm (.Rega, 2001). Cũng cần lưu ý rằng khi cấy vào chuột suy giảm miễn dịch nhân bản PGCs với karyotype bình thường và u quái hình thành bao gồm một loạt các loại tế bào soma biệt. Những dữ liệu thực nghiệm này là bằng chứng hoàn hảo về nguồn gốc dòng vô tính của teratom. Từ góc nhìn của sinh học phát triển, họ cho rằng nó không phải là bội số của tế bào nguyên bản cam kết và bản sắc tế bào gốc đa năng là nguồn gốc của các dẫn xuất khác biệt của cả ba lớp mầm, thành phần u quái. Tuy nhiên, trong các kết quả cấy ghép tế bào thực tiễn của những nghiên cứu này là, nếu không cấm, sau đó là một dấu hiệu cảnh báo nguy hiểm tiềm năng, vì ESC cấy hoặc các tế bào mầm nguyên thủy trong các mô khác nhau của chuột miễn dịch của người lớn không tránh khỏi gây ra sự phát triển của các khối u từ tế bào gốc cấy. Thoái hóa ung thư ectopically cấy ESC kèm theo sự xuất hiện của các quần vệ tinh của các tế bào khác biệt - bằng một phần phân biệt chắc chắn là ESCs và nhái tổ tiên dành riêng dòng. Thật thú vị, khi cấy ESC vào cơ xương bên cạnh tế bào ung thư biểu mô tế bào, các nơ-ron được hình thành nhiều nhất. Tuy nhiên, trong PGCs hành Mace trứng hoặc phôi nang kèm theo tích hợp đầy đủ trong các tế bào mầm mà không có sự hình thành của các tế bào ung thư. Trong trường hợp này, ESCs được xây dựng vào hầu như tất cả các cơ quan và các mô của phôi, bao gồm cả thô sơ giới tính. động vật allofennye như đã được chuẩn bị đầu tiên phải chịu các tế bào teratocarcinoma 129 trong giai đoạn đầu của phôi tại 8-100 tế bào. Trong allofennyh dân chuột geterogenomnyh PGCs hiến tế bào có nguồn gốc từ được đưa vào tủy xương, ruột, da, gan và bộ phận sinh dục, cho phép bạn tạo ra trong thí nghiệm thậm chí giữa các loài Chimeras tế bào. Các thời điểm phôi ban đầu nhỏ hơn, cao hơn tỷ lệ chimerization thoại di động, các chimerization độ cao nhất quan sát trong hệ thống tạo máu, da, hệ thần kinh, gan và ruột non allofennogo phôi. Trong cơ thể người lớn mô chimerization tuân bảo vệ khỏi tiếp xúc với hệ thống miễn dịch trong những rào cản nhận gistogematicalkie: cấy ghép tế bào mầm nguyên thủy trong nhu mô tinh hoàn kèm theo chèn các tế bào gốc của nhà tài trợ vào lớp người nhận mô germenativny. Tuy nhiên, ESC cấy ghép thành một hình phôi nang cơ quan sinh dục sơ khởi khảm với thế hệ các nhà tài trợ tế bào mầm nguyên thủy không xảy ra. ESC pluripotency khi tạo điều kiện đặc biệt và có thể được sử dụng để nhân bản: ESC cấy chuột 8-16 cell chuột phôi, tế bào phân bào trong đó tsitokalazinom chặn, góp phần vào việc tạo phôi bình thường với sự phát triển của các nhà tài trợ PGCs phôi.

Do đó, một sự thay thế là ghép đồng loại nhân bản liệu pháp ESC dựa trên cấy ghép nhân tế bào soma vào một noãn bào enucleated để tạo ra một khối tế bào bên túi phôi từ mà sau đó được phân bổ dòng PGCs nhà tài trợ giống hệt nhau về mặt di truyền soma hạt nhân. Về mặt kỹ thuật, ý tưởng này là khả thi, vì khả năng tạo ra các dòng hESC từ phôi nang thu được sau khi cấy hạt nhân soma vào tế bào trứng enucleated nhiều lần chứng minh trong các thí nghiệm trên động vật thí nghiệm (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Đặc biệt ở chuột đồng hợp tử cho rag2 đột biến, các nguyên bào sợi thu được bằng cách nuôi cấy tế bào mô subepidermal được sử dụng như hạt nhân của nhà tài trợ được cấy vào trứng enucleated. Sau khi kích hoạt, tế bào trứng "hợp tử" nuôi cấy cho đến khi hình thành túi phôi, từ khối tế bào bên trong là PGCs bị cô lập và đi qua chúng thành một dòng cho các tế bào gen nullizigotnyh đột biến (rag2 ~ / ~). Bằng phương pháp tái tổ hợp tương đồng trong các ESCs như vậy, đột biến của một gen allelic đã được điều chỉnh. Trong loạt đầu tiên của thí nghiệm từ hESCs gen tái tổ hợp phục hồi cơ quan embryoid đã được chuẩn bị, transfected tế bào của chúng có một retrovirus tái tổ hợp (HoxB4i / GFP) và sau khi tuyên truyền ở chuột được tiêm tĩnh mạch rag2 ~ / ~. Trong loạt thứ hai, các blastomeres tứ bội đã được tổng hợp với ESCs biến đổi gen và cấy ghép cho người nhận nữ của họ. Các con chuột sinh ra năng lượng đã phục vụ như là những người hiến tủy xương để cấy ghép chuột đột biến rag2 ~ / ~. Trong cả hai loạt, kết quả là dương tính: 3-4 tuần trong tất cả các con chuột của các tế bào dòng tủy và bạch huyết trưởng thành bình thường đã được tìm thấy khả năng sản xuất globulin miễn dịch. Do đó, cấy ghép vào hạt nhân noãn bào của các tế bào soma có thể được sử dụng không chỉ để sản xuất dòng hESC, mà còn cho tsitogenoterapii - Sửa chữa các bất thường di truyền sử dụng ESC như một vector cho vận chuyển sửa thông tin di truyền. Nhưng theo hướng di chuyển tế bào này, ngoài các vấn đề về đạo đức sinh học, còn nhiều hạn chế. Nó không phải là rõ ràng như thế nào an toàn các cấy ghép sẽ được trị liệu nhân bản tế bào với một kiểu gen giống với kiểu gen của một bệnh nhân đặc biệt, bởi vì các tế bào đó có thể giới thiệu đột biến tạo ra một khuynh hướng bệnh nhất định. Trứng con người bình thường vẫn không thể tiếp cận đối tượng, trong khi ngay cả khi cấy hạt nhân soma vào noãn bào động vật enucleated chỉ 15-25% thiết kế "hợp tử" phát triển đến giai đoạn phôi nang. Nó không phải là xác định bao nhiêu phôi nang được yêu cầu để có được một dòng duy nhất của ESCs nhân bản đa năng pluripotent. Cần lưu ý và mức chi phí tài chính cao liên quan đến sự phức tạp của phương pháp nhân bản điều trị.

Tóm lại, trong bộ gen pluripotency ESC hypomethylated DNA được kết hợp với hoạt tính của telomerase cao và giai đoạn C ^ chu kỳ tế bào ngắn, đảm bảo nhân chuyên sâu và có khả năng vô hạn, trong đó PGCs giữ lại nhiễm sắc thể lưỡng bội và "vị thành niên" tập hợp các đặc điểm kiểu hình. Tăng trưởng vô tính của PGCs trong văn hóa không ngăn cản chúng biệt hóa thành bất kỳ tế bào chuyên biệt của cơ thể tại một sự gia tăng dòng dừng lại và thêm tín hiệu điều chỉnh phù hợp. Hạn chế phân hóa của hESCs phù hợp trong tế bào soma vitro được thực hiện mà không có sự tham gia của các trung mô, bỏ qua Nohteyaov, là phát sinh cơ quan và không có sự hình thành của phôi. Quản lý ESC trong cơ thể vivo chắc chắn dẫn đến sự hình thành u ác tính. ESC cấy ghép thành một túi phôi hoặc phôi ban đầu kèm theo hội nhập của họ với các mô của phôi thai và các cơ quan chimerization ổn định của nó.

Công nghệ tái sinh và nhựa dựa trên cấy ghép tế bào là điểm giao nhau của các lợi ích của các thành viên trong sinh học tế bào, sinh học phát triển, di truyền học thực nghiệm, miễn dịch học, thần kinh, tim mạch, huyết học, và nhiều lĩnh vực khác của y học thực nghiệm và thực tiễn. Các kết quả thực nghiệm quan trọng nhất chứng minh khả năng tái lập trình các tế bào gốc với sự chỉ đạo của sự thay đổi các thuộc tính của họ, mà mở ra triển vọng cho việc kiểm soát quá trình cytodifferentiation với yếu tố tăng trưởng - cho tái tạo máu cơ tim, phục hồi các tổn thương thần kinh trung ương và bình thường hóa chức năng của bộ máy đảo của tụy. Tuy nhiên, các dẫn xuất giới thiệu cấy trên diện rộng ESC trong hành nghề y là cần thiết để điều tra các thuộc tính của các tế bào gốc của con người một cách chi tiết hơn và các thí nghiệm tiếp tục với PGCs trong các mô hình thực nghiệm của bệnh.

Vấn đề đạo đức sinh học và các vấn đề ruồng bỏ cấy ghép tế bào đồng loại có thể giải quyết vấn dẻo quan sát của bộ gen của tế bào gốc trưởng thành trong khu vực. Tuy nhiên, thông tin ban đầu là khi cấy gan tế bào tạo máu tự thân bị cô lập và đặc điểm kỹ lưỡng, trong đó có tế bào gan mới, kết hợp vào tiểu thùy gan, hiện nay đang được xem xét và chỉ trích. Tuy nhiên, công bố dữ liệu việc cấy ghép tế bào gốc thần kinh trong tuyến ức là sự hình thành mầm mới của các nhà tài trợ T-và B-lymphocyte, và cấy tế bào gốc thần kinh của não bộ trong tủy xương dẫn đến sự hình thành mầm duy trì dòng tủy hiến máu và hồng cầu . Do đó, trong các cơ quan của người lớn có thể được bảo quản tế bào gốc đa năng có khả năng tái lập trình bộ gen của ESC để năng lực.

Phôi thai người vẫn là nguồn tiếp nhận ESC cho mục đích y tế, xác định trước sự không thể tránh khỏi của một giao điểm mới về các vấn đề luân lý, đạo đức, đạo đức, pháp lý và tôn giáo vào thời điểm sự ra đời của con người. Việc khám phá ra các ESCs đã tạo ra một động lực mạnh mẽ cho việc nối lại các cuộc thảo luận khắc nghiệt về nơi mà các tuyến giữa tế bào sống và vật chất, chất và tính cách nằm. Đồng thời, không có các quy tắc, quy tắc và luật lệ phổ quát về việc sử dụng ESC trong y học, mặc dù đã nhiều lần cố gắng tạo ra và chấp nhận chúng. Mỗi quốc gia trong pháp luật của mình giải quyết vấn đề này một mình. Về phần mình, bác sĩ từ khắp nơi trên thế giới tiếp tục cố gắng phát triển y học tái tạo trên các cuộc thảo luận, chủ yếu thông qua việc sử dụng tế bào gốc không phôi, và dự trữ tế bào gốc của cơ thể người lớn.

Một số trong lịch sử của sự cô lập tế bào gốc phôi thai

Terato- tế bào (phôi) được phân lập từ -kartsinomnye một cách tự nhiên xảy ra tinh hoàn u quái chuột căng thẳng 129 tế bào / ter-Sv, tự phát buồng trứng dòng u quái chuột Lt / Sv, và từ u quái, ektopichno nguồn được cấy hoặc mô phôi. Trong số dòng do đó thu được terato- ổn định chuột (phôi) -kartsinomnyh một số tế bào gốc toàn năng, những người khác đã phải chịu sự phân biệt chỉ trong các tế bào của một loại đặc biệt, và một số đã được thường không có khả năng cytodifferentiation.

Vào thời điểm đó, trọng tâm là nghiên cứu cho thấy một terato- có thể trở lại (phôi) tế bào -kartsinomnyh đến kiểu hình bình thường sau khi giới thiệu của họ trong các mô phôi đang phát triển, cũng như làm việc để tạo ra in vitro terato- biến đổi gen (phôi) -kartsinomnyh tế bào, với sự giúp đỡ của những con chuột đột biến thu được để mô hình hóa sinh học của bệnh học di truyền của con người.

Trồng trọt có điều kiện được sử dụng để cô lập các dòng tế bào ung thư phôi-phôi. Trong terato- văn hóa (phôi) -kartsinomnye tế bào, giống như ESCs, phát triển để hình thành các cơ quan embryoid và yêu cầu được dịch sang một dòng phân ly ràng buộc duy trì pluripotency trên một lớp feeder nguyên bào sợi phôi hoặc nuôi treo trong môi trường có điều kiện. Terato- tế bào gốc toàn năng (phôi) - dòng ung thư biểu mô lớn, hình cầu, có một hoạt động cao của phosphatase kiềm, hình thức uẩn và có khả năng phân biệt đa chiều. Khi được đưa vào một túi phôi được tổng hợp với phôi dâu, dẫn đến sự hình thành của phôi khảm, trong các cơ quan khác nhau và các mô mà phái sinh được tìm thấy terato- (phôi) tế bào -kartsinomnyh. Tuy nhiên, đại đa số các phôi khảm như chết trong tử cung, và trong các cơ quan sống sót Chimeras tế bào nước ngoài sơ sinh và hiếm khi phát hiện với mật độ thấp. Đồng thời tỷ lệ mắc khối u (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, và các loại sưng ác tính và u tuyến tụy) tăng mạnh, và thoái hóa ung thư thường xảy ra ngay cả trong phôi khảm tử cung.

Hầu hết các tế bào ung thư phôi-phôi trong môi trường vi mô của tế bào phôi bình thường gần như tự nhiên có đặc điểm ung thư ác tính. Người ta tin rằng ung thư ác tính không thể đảo ngược là do sự kích hoạt các proto-oncogenes trong quá trình sắp xếp lại cấu trúc. Một ngoại lệ là những dòng tế bào embriokartsinomnoy SST3, u quái có nguồn gốc từ tinh hoàn chuột (dòng 129 / Sv-ter), trong đó thể hiện một khả năng cao để tích hợp vào các mô và các cơ quan của thai nhi mà không có sự hình thành tiếp theo của các khối u ở chuột khảm. Phái sinh terato- (phôi) dòng tế bào -kartsinomnyh ở chuột Chimeras hầu như không tham gia vào sự hình thành của gonocytes chính. Rõ ràng, nó được kết nối với một tần số cao của quang sai nhiễm sắc thể phổ biến đối với hầu hết terato- (phôi) dòng -kartsinomnyh trong đó các tế bào quan sát như thể dị bội hoặc bất thường nhiễm sắc thể.

Trong phòng thí nghiệm, đã thu được một số dòng ổn định của ung thư phôi-phôi-người, đặc trưng của pluripotency, hoạt động tăng sinh cao và khả năng phân biệt với sự phát triển trong nuôi cấy. Đặc biệt, dòng tế bào ung thư phôi-người-phôi-người-NTERA-2 đã được sử dụng để nghiên cứu cơ chế giải mã cytologic. Sau khi cấy ghép các tế bào của tuyến này vào vùng não thất của não vị thành niên, sự di cư và sự hình thành neuronogenes của chúng đã được quan sát thấy. Đã có thậm chí cố gắng để cấy ghép tế bào thần kinh terato- thu được bằng cách nuôi cấy tế bào (phôi) -kartsinomnoy dòng NTERA-2, để những bệnh nhân bị đột quỵ, trong đó, theo các tác giả, dẫn đến sự cải thiện lâm sàng của bệnh. Đồng thời, không thấy trường hợp các tế bào cấy ghép ác tính của ung thư phôi-phôi NTERA-2 ở bệnh nhân bị đột qu..

Evans và Martin đã nhận được những dòng đầu tiên của các tế bào gốc phôi đa năng không phân biệt ở chuột vào đầu những năm 80 của thế kỷ trước, cách ly chúng khỏi khối lượng tế bào bên trong phôi nang, phôi thai. Các dòng ESC bị cô lập trong một thời gian dài được bảo toàn và khả năng phân biệt thành các loại tế bào khác nhau dưới ảnh hưởng của các yếu tố của môi trường nuôi đặc biệt.

Thuật ngữ "phôi tế bào gốc đa năng" thuộc Leroy Stevens rằng cuộc điều tra của tác động tar thuốc lá trên tần số của sự phát triển khối u đã thu hút sự chú ý đến sự xuất hiện của teratocarcinoma tự tinh hoàn của tuyến tính (129 / v) của chuột của nhóm đối chứng. Tế bào teratocarcinoma tinh hoàn được đặc trưng bởi tốc độ phổ biến cao, và trong sự hiện diện của chất lỏng còn lại trong khoang bụng với sự hình thành của sự khác biệt tự nhiên của tế bào thần kinh, tế bào sừng, tế bào sụn, cardiomyocytes, cũng như tóc và xương mảnh, nhưng không có bất kỳ dấu hiệu của một cytoarchitectonics ra lệnh mô thích hợp. Khi trồng trong nuôi cấy tế bào teratocarcinoma phát triển tự do để các dòng vô tính đa năng bề mặt và các cơ quan embryoid hình thành sau đó được dập tắt và phải chịu sự mất trật tự phân hạch tự phát biệt hóa thành tế bào thần kinh, thần kinh đệm, tế bào cơ và cardiomyocytes. Stevens phát hiện ra rằng teratocarcinoma chuột 129 / v chứa ít hơn 1% của các tế bào có khả năng phân biệt thành nhiều dòng soma chuyên ngành, và bản thân sự khác biệt phụ thuộc vào các yếu tố có ảnh hưởng đến họ (thành phần chất lỏng phân phúc mạc, các sản phẩm bổ sung vào nền văn hóa của các tế bào trưởng thành hoặc mô). Leroy Stevenson giả định về sự hiện diện giữa các tế bào teratocarcinoma tổ tiên phôi tế bào mầm tình dục đã khẳng định: việc đình chỉ embryoblast tế bào phôi preimplantation trong các mô của chuột trưởng thành hình thành teratocarcinoma, và tách ra khỏi họ dòng tế bào tinh khiết sau khi tiêm trong phúc mạc với động vật nhận đã biệt hóa thành tế bào thần kinh, cardiomyocytes và kletki soma khác các dẫn xuất của cả ba lớp mầm. Trong các thí nghiệm trong cấy ghép vivo ESK (lấy từ embryoblast nhưng không lá nuôi phôi) trong phôi chuột ở các giai đoạn khác nhau dòng 8-32 blastomere kết thúc đời của con vật khảm (không hình thành khối u) trong các cơ quan đó phát hiện mô mầm tài trợ. Chimerism đã được quan sát ngay cả trong dòng tế bào giới tính.

Tế bào mầm nguyên bản chính được phân lập từ chuột phôi mầm quan hệ tình dục, hình thái, kiểu hình miễn dịch và đặc điểm chức năng phù hợp với hESCs có nguồn gốc từ teratocarcinoma Stevenson và embryoblast. Tại Chimeras sinh sau khi uống hESCs thành một túi phôi, allofenny hình thái cơ quan đặc trưng của nhà tài trợ xen kẽ khảm và nhận về cấu trúc và các đơn vị chức năng của gan, phổi và thận. Trong một số trường hợp, người ta đã quan sát được sự hình thành các mật mã hoặc túi mật trong ruột bao gồm đồng thời của người nhận và các tế bào hiến. Tuy nhiên, luôn luôn nhận ra sự hình thành hình thái xảy ra theo chương trình di truyền của loài mà người nhận đã thuộc về, và thụ tinh chỉ giới hạn ở mức độ tế bào.

Sau đó, người ta phát hiện ra rằng sự gia tăng của hESCs mà không cytodifferentiation trên một feeder tế bào trung mô lớp có nguồn gốc từ (nguyên bào sợi bào thai) xảy ra trong sự hiện diện của LIF ràng buộc trong môi trường dinh dưỡng chọn lọc mà có chọn lọc cung cấp chỉ tồn tại của tế bào gốc và tổ tiên, trong khi đại đa số các yếu tố tế bào chuyên chết. Với sự giúp đỡ của những kỹ thuật này vào năm 1998 bởi James Thomson đã được phân bổ năm dòng bất tử của tế bào gốc phôi từ khối tế bào bên trong của một người phôi nang. Cùng năm đó, John Gerhart đã phát triển một phương pháp cách ly các dòng ESC bất tử từ phun tình dục của phôi người 4-5 tuần. Do đặc tính độc đáo của nó, chỉ hai năm sau đó phôi tế bào gốc và tế bào gốc mô dứt khoát đã bắt đầu được sử dụng trong việc thực hành y học tái tạo và liệu pháp gen.