Mô hình thử nghiệm viêm xương khớp

Sụn là mô chuyên biệt chỉ chứa một loại tế bào (chondrocytes), đặc trưng bởi sự vắng mặt của mạch máu và bạch huyết. Dinh dưỡng của sụn chủ yếu được thực hiện bởi sự hấp thụ từ dịch khớp. Sự trao đổi chất của chondro-cytes được điều chỉnh bởi một số yếu tố hòa tan được sản xuất cục bộ bởi các tế bào chondrocytes và các mô xung quanh. Chức năng của tế bào chondrocytes cũng phụ thuộc vào thành phần của môi trường ngoài tế bào (sự căng thẳng oxy, nồng độ ion, pH, vv), thành phần VCM, tương tác tế bào và ma trận, các tín hiệu vật lý. Nhiệm vụ chính của mô hình thí nghiệm là tạo ra các nền văn hoá trong môi trường ngoài tế bào mà không thay đổi kiểu hình của các tế bào trưởng thành. Nhiệm vụ thứ hai là tạo ra các nền văn hoá để nghiên cứu sự đáp ứng sớm của tế bào chondrocytes, chậm hoặc ngắn hạn đối với các tín hiệu hóa học và / hoặc vật lý. Các nghiên cứu in vitro cũng cung cấp một cơ hội để nghiên cứu hành vi của sụn trong viêm xương khớp. Nhiệm vụ thứ ba là phát triển các hệ thống điều trị đồng thời cho phép nghiên cứu sự tương tác của các mô khác nhau trong khớp. Nhiệm vụ thứ tư là chuẩn bị các cấy ghép sụn cho việc cấy ghép sau đó. Và, cuối cùng, nhiệm vụ thứ năm là nghiên cứu các yếu tố tăng trưởng, cytokine hoặc các chất điều trị có khả năng kích thích việc sửa chữa và / hoặc ức chế sự resorption sụn.

Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều mô hình nuôi cấy tế bào sụn khác nhau, bao gồm các nền văn hoá đơn bào, nền văn hoá treo, nền văn hoá chondron, các loại cấy, nuôi cấy, nuôi cấy tế bào bất tử. Mỗi nền văn hoá có những thuận lợi và bất lợi của nó và mỗi loại đều thích hợp để nghiên cứu một khía cạnh đặc biệt của sự trao đổi chất chondrocyte. Do đó các phôi dạng sụn là một mô hình tuyệt vời để nghiên cứu doanh thu của các yếu tố ma trận, đòi hỏi các thụ thể bề mặt tế bào chính xác và ma trận tế bào bình thường và các tương tác tế bào ma trận. Đồng thời, nghiên cứu về trầm tích trong ma trận hoặc các cơ chế để điều hòa quá trình trao đổi chondrocyte được khuyến cáo thực hiện trên một nền văn hoá các tế bào bị cô lập. Một nền văn hoá mật độ thấp đơn lớp là cần thiết để nghiên cứu quá trình phân biệt tế bào. Các nền văn hoá bị lơ lửng trong một ma trận tự nhiên hoặc tổng hợp là một mô hình để phân tích phản ứng thích ứng của các tế bào chondroce với stress cơ học.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

Nền văn hoá Chondrocyte

Khi chọn mô sụn cho các nghiên cứu in vitro, một số điểm quan trọng cần được xem xét. Thành phần của ma trận và hoạt động trao đổi chất của tế bào sụn thay đổi trong các khớp khác nhau, và thứ hai cũng phụ thuộc vào độ sâu của tế bào chondrocyte trong mô. Những dữ liệu này thu được trong một số thí nghiệm trong đó các tiểu đơn vị phân lập của tế bào chondrocytes từ các vùng sụn ở các độ sâu khác nhau được nghiên cứu. Một số sự khác biệt hình thái và sinh hóa đã được tìm thấy giữa các tế bào chondrocytes được trồng ở bề mặt và các lớp sâu của sụn khớp. Các tế bào bề mặt tổng hợp một ma trận protein proteoglycan hiếm hoi, trong khi các tế bào sâu hơn tạo ra một ma trận có nhiều sợi và proteoglycans. Hơn nữa, các tế bào trên bề mặt tạo ra các proteoglycans và axit hyaluronic không nhỏ hơn tương đối nhỏ và sulfate aggrecan và keratan tương đối ít hơn những tế bào chondrocytes nằm sâu hơn. Một đặc điểm phân biệt quan trọng khác của quá trình trao đổi chất của tế bào chondrocytes phân lập từ các vùng sụn ở các độ sâu khác nhau là phản ứng với kích thích ngoại sinh. Theo M. Aydelotte và các đồng tác giả, các tế bào chondron từ vùng bề mặt sụn nhạy cảm với IL-1 hơn các tế bào ở vùng sâu.

Hành vi của các tế bào cũng phụ thuộc vào vị trí của mô. Sụn sụn và tai cạnh, lấy từ động vật tương tự mà phản ứng khác nhau với các yếu tố tăng trưởng như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF), và TGF-beta. FGF tăng thymidine thành lập, prolin và leucine với nền văn hóa của tế bào sụn sườn nhưng không phải là tai. TGF-P tăng sự kết hợp của thymidine thành tế bào sụn sụn sườn và tai, nhưng không có hiệu lực từ ngày thymidine gắn vào tế bào sụn và tai prolin. Các tế bào sụn thu được từ các vùng có tải lớn nhất khác với tế bào từ các vị trí có tải trọng thấp trên sụn. Ví dụ, tế bào sụn trưởng thành của sụn của khớp gối từ khu vực trung tâm của bề mặt xương chày xương cừu khớp không nằm trong khum, có thể mang theo tải trọng lớn nhất trong cơ thể, aggrecan tổng hợp nhỏ hơn, decorin nhưng lớn hơn so với các tế bào của các lĩnh vực thuộc phạm vi khum. Các tác giả cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng sụn khớp từ các vùng khớp giống nhau khi kiểm tra chức năng tổng hợp của các khớp.

Sự trao đổi chất của tế bào chondrocytes và phản ứng của chúng đối với các yếu tố điều hòa cũng phụ thuộc đáng kể vào tuổi của người hiến, sự phát triển bộ xương của nó và trạng thái của các khớp từ đó các tế bào được lấy ra. Trong tế bào chondrocytes của con người, có sự giảm đáng kể theo tuổi phản ứng tăng sinh. Sự sụt giảm lớn nhất được ghi nhận ở các nhà tài trợ trong độ tuổi 40-50 và trên 60 năm. Hơn nữa, mức độ nghiêm trọng của phản ứng tăng sinh đối với các yếu tố tăng trưởng (ví dụ, FGF và TGF-beta) giảm trong quá trình lão hóa. Ngoài các thay đổi về số lượng trong sự gia tăng của tế bào chondrocytes, cũng có những thay đổi về chất lượng. Các tế bào hiến tạng trẻ (10-20 tuổi) phản ứng tốt hơn với PDGF hơn là TGF-beta, ngược lại ngược lại ở những tế bào hiến tạng người lớn. Để giải thích sự thay đổi tuổi tác trong chức năng tổng hợp của tế bào chondrocytes và phản ứng của chúng đối với hiệu quả của các yếu tố tăng trưởng, một số cơ chế được sử dụng. Trong số đó có sự suy giảm về số lượng và ái lực của các thụ thể tế bào bề mặt, sự thay đổi tổng hợp và hoạt tính sinh học của các yếu tố tăng trưởng và cytokine, một sự thay đổi tín hiệu nhận sau.

Tình trạng bệnh lý của khớp cũng làm thay đổi hình thái học và hoạt động trao đổi chất của các tế bào chondrocytes. Vì vậy, J. Kouri và các đồng tác giả (1996) đã xác định ba tiểu nhóm con của tế bào chondrocytes trong sụn với viêm xương khớp. Chondrocytes từ trên bề mặt và trên giữa của các nhóm hình sụn và tổng hợp proteoglycans và collagen hơn. TGF-beta, và yếu tố tăng trưởng giống Insulin (IGF) có thể kích thích sự tổng hợp proteoglycan bởi tế bào sụn và một phần trung hòa ảnh hưởng của IL-1 và TNF-a. Cấy sụn bị mắc chứng viêm xương khớp, và các tế bào sụn phân lập từ sụn của những bệnh nhân bị viêm xương khớp, nhạy cảm hơn với kích thích của TGF-beta hơn sụn sụn khỏe mạnh. Những khác biệt này có thể liên quan đến sự thay đổi kiểu hình trong tế bào chondrocytes ở các lớp thượng bì của sụn khớp.

Sự phân lập các tế bào chondrocytes riêng lẻ được thực hiện bằng cách điều trị tuần tự với các enzyme proteolytic của ECM. Sau khi được giải phóng khỏi ECM, các tế bào riêng biệt rất lý tưởng cho việc nghiên cứu tổng hợp các thành phần ma trận de novo. Một số tác giả chỉ sử dụng clostridium collagenase, một số khác lại ấp trước sụn với trypsin, pronase, DNase và / hoặc hyaluronidase. Số tế bào bị cô lập phụ thuộc vào các enzyme được sử dụng. Vì vậy, khi chế biến một trong những mô collagenase 1 g có thể thu được 1,4T0 ⁶ tế bào sụn, trong khi đó khi sử dụng pronase, hyaluronidase và collagenase - 4,3-10 ⁶. Khi chế biến với collagenase, aggrecan, protein, IL-6, IL-8 vẫn còn trong nuôi cấy tế bào nhiều hơn trong trường hợp điều trị liên tục với các enzym khác nhau. Có một số giải thích cho sự khác biệt giữa hai nền văn hoá tế bào:

• thụ thể tế bào bị hư hỏng hoặc bị trầm cảm do tác động của enzyme, TGF-beta ức chế tổng hợp DNA của proteoglycan trong sụn mới bị cô lập (ngày 1), trong khi tổng hợp DNA và proteoglycan của sụn nuôi cấy trong đơn lớp (7 ngày) kích thích bởi TGF-beta. Tuy nhiên, để tái diễn xuất các thành phần màng này, cần phải có khoảng thời gian thích hợp trước khi bắt đầu thử nghiệm.
• Protease ngoại sinh có thể phá vỡ sự tương tác giữa các tế bào và ma trận, trung gian bởi sự tích phân. Gia đình integrin thúc đẩy việc gắn các tế bào chondrocytes vào các phân tử VKM (Shakibaei M. Et al., 1997). Sự vỡ này có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen ma trận.
• Phế tích của các thành phần ma trận có thể điều chỉnh chức năng tổng hợp của tế bào chondrocytes. Integrins có thể nhận ra sản phẩm xuống cấp của ECM, do đó đóng một vai trò quan trọng trong việc sửa chữa mô sau khi tiếp xúc với các enzyme proteolytic. T. Larsson et al (1989) báo cáo rằng việc bổ sung các proteoglycans nguyên vẹn hoặc bị phân mảnh trong các tế bào nuôi cấy kích thích quá trình tổng hợp protein và proteoglycans. Tuy nhiên, mức độ axit hyaluronic làm giảm đáng kể sự bao gồm tổng hợp proteoglycan sulfate bởi sụn phôi gà sụn trưởng thành tế bào lợn và chuột sụn. Hơn nữa, hyaluronic acid - chất ức chế phát hành proteoglycan từ các tế bào ngay cả trong sự hiện diện của IL-lb, TNF-a, FGF, chỉ ra rằng người đầu tiên chống lại hoạt tính sinh học của các yếu tố tăng trưởng và các cytokine. Cơ chế chính xác cơ bản hoạt động của axit hyaluronic vẫn còn chưa rõ ràng; biết rằng bao gồm thụ thể tế bào sụn cho axit hyaluronic kết hợp với sợi actin bào tương. Sự gắn kết của axit hyaluronic với thụ thể của nó kích thích sự phosphoryl hóa các protein. Do đó, những dữ liệu chứng minh các chức năng trao đổi chất điều chỉnh của tế bào sụn tự nhiên hoặc protein phân tử ma trận phân mảnh bằng cách kích hoạt các thụ thể màng tế bào.
• Sự kích thích nhanh bởi các enzyme của việc tổng hợp các protein ma trận bằng các tế bào chondrocytes có thể là kết quả của sự thay đổi hình dạng của tế bào chondrocytes và / hoặc sự tái tổ chức của bộ khung tế bào.
• Một số cytokine (ví dụ, IL-8) và các yếu tố tăng trưởng (như IGF-1, TGF-P) được cố định trong ECM. Ví dụ tốt nhất được biết đến là sự kết hợp của TGF-beta với decore, dẫn đến sự suy giảm khả năng của tế bào gốc trước khi gây ra sự tăng trưởng tế bào trong tế bào buồng trứng ở chuột hamster Trung Quốc. Các dữ liệu cho thấy nội dung của trang trí sụn làm tăng theo độ tuổi, cho thấy sự giảm sinh khả dụng của TGF-beta khi lão hóa. Các yếu tố tăng trưởng và các cytokine có thể được giải phóng khỏi dư lượng ma trận trong quá trình nuôi cấy và sau đó điều chỉnh chức năng của tế bào chondrocyte.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Nuôi đơn bào chondrocytes

Hình thái khác biệt của tế bào chondrocytes chủ yếu được đặc trưng bởi sự tổng hợp collagen type II và các proteoglycans đặc hiệu mô, cũng như mức hoạt động phân bào thấp. Có bằng chứng cho thấy việc trồng trọt kéo dài các tế bào trong một lớp đơn và sau vài lần lặp đi lặp lại các tế bào, các tế bào chondrocytes bị mất các đường viền hình cầu, có hình dạng dài, dạng nguyên bào sợi. Với ví dụ nguyên bào sợi chuyển sản chức năng tổng hợp cũng được sửa đổi tế bào, đặc trưng bởi sự suy giảm liên tục trong quá trình tổng hợp của Collagen II, IX và các loại XI và cải thiện tổng hợp collagen I, III và Utipov. Proteoglycans không tổng hợp nhỏ được tổng hợp bởi chức năng aggrecan. Synthetzatepsin B và L cực kỳ thấp trong các tế bào phân biệt, nhưng trong quá trình mất sự khác biệt gia tăng. Collagenase-1 được biểu hiện ở những tế bào chẻ khác biệt, với sự canh tác kéo dài, sự biểu hiện của nó giảm, trong khi sản xuất các chất ức chế mô của các chất gây mê bằng kim loại (TIMP) tăng lên.

Các chondrocytes khác biệt tái biểu hiện collagen của các kiểu hình khác biệt khi chúng được chuyển từ một nền văn hoá đơn lớp sang một hệ thống treo. Quá trình phân biệt có lẽ liên quan đến hình dạng của các tế bào. Tài sản này thường được sử dụng bởi các nhà nghiên cứu nghiên cứu các cấy ghép có khuyết tật với các tế bào chond autologous. Một số ít các tế bào thu được từ một vật liệu sinh thiết có thể được nhân lên trong một môi trường đơn lớp và sau đó đặt lại trong một ma trận ba chiều trước khi cấy ghép. Sự biểu hiện lại của một kiểu hình cụ thể do các tế bào chondrocytes khác chuyển sang nuôi cấy có thể được kích thích với TGF-p, phức hợp ossein hydroxyapatit và acid ascorbic.

Để đáp ứng với hiệu quả của các yếu tố tăng trưởng và cytokines, tế bào sụn được thay đổi trong quá trình phân biệt. Phản ứng tế bào đối với cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác nhau giữa các tế bào chondrocyte không phân biệt và khác biệt. IL-1 kích thích sự phát triển của nguyên bào sợi, trong khi sự phát triển của tế bào chẻ không phân tách được ức chế bởi IL-1. Tổng hợp DNA được kích thích bởi IGF-1 trong các tế bào chondro dài nhưng không phải là phẳng. Trong các tế bào chondrocytes khác nhau, các tác động kích thích của IL-1β và TNF-α đối với các sản phẩm procollagenase được phát hiện rõ rệt hơn so với những tế bào không phân biệt.

Trồng trondrocytes

Việc tạo ra tế bào chondrocytes trong dung dịch trong môi trường lỏng hoặc trong một ma trận ba chiều tự nhiên hoặc tổng hợp ổn định kiểu hình của tế bào nang. Các tế bào giữ lại hình dạng hình cầu, tổng hợp các protein mô cụ thể. Một nền văn hóa chondrocyte cân thường được đề nghị để nghiên cứu sự hình thành một ma trận bào nội mô mới. Nuôi cấy tế bào chondrocyte trong polyme tổng hợp hoặc tự nhiên thấm được sử dụng để cấy ghép các tế bào vào các khiếm khuyết sụn để kích thích tái tạo các mô sụn khớp của khớp. Môi trường tổng hợp hoặc tự nhiên đối với tế bào cấy ghép phải đáp ứng một số yêu cầu:

• Cấy ghép phải có cấu trúc xốp để bám dính và tăng trưởng tế bào,
• bản thân polyme cũng như các sản phẩm của sự xuống cấp của nó không gây ra phản ứng viêm hoặc độc trong khi cấy ghép trong cơ thể ,
• người vận chuyển cấy ghép phải có khả năng gắn kết với một sụn kế hoặc xương dưới xương sống,
• một ma trận tự nhiên hoặc tổng hợp phải có khả năng hấp thụ, sự xuống cấp của nó phải được cân bằng bởi sự tái tạo mô,
• Để tạo thuận lợi cho việc sửa chữa sụn, cấu trúc hóa học và kiến trúc ma trận của ma trận sẽ giúp duy trì các kiểu hình tế bào được chèn vào trong các tế bào chondrocytes và tổng hợp protein đặc hiệu mô,
• trong quá trình cấy trong cơ thể, cần nghiên cứu các tính chất cơ học của ma trận tổng hợp hoặc tự nhiên.

[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]

Đình chỉ các tế bào chondrocytes trong pha lỏng

Tập tin đính kèm di động để tàu nhựa, trong đó nuôi của tế bào sụn có thể được ngăn chặn bức tường của họ được phủ một giải pháp methyl cellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylate) hoặc hỗn hợp của collagen-agarose. Dưới những điều kiện, cụm hình thức và sụn tổng hợp mô-cụ thể aggrecan và collagen (II, IX, các loại XI) chủ yếu. Thông thường, có hai loại tế bào được tìm thấy. Các tế bào nằm ở trung tâm giữ một hình cầu được bao quanh bởi một ECM phát triển tốt, được xác nhận bởi các nghiên cứu histochemical và siêu cấu trúc. Trên các tế bào chondrocytes ngoại vi có đường viền discoid, được bao quanh bởi một ECM hiếm hoi; Ít được biết về các đặc tính chức năng của các tế bào như vậy.

Có thể nuôi cấy tế bào chondrocytes trên các microcarriers; như microcarriers sử dụng hạt dextran (tsitodeks), collagen bọc hạt dextran (tsitodeks III), microspheres besporovye là collagen type I (tsellagen). Trong những điều kiện nuôi cấy này, các tế bào chondrocytes gắn với bề mặt của microcarrier, giữ lại hình cầu, và tạo ra một vật liệu giống như ma trận. Hơn nữa, việc sử dụng collagen kích thích sự phát triển của tế bào chondrocytes và việc tái hiện lại một kiểu hình bình thường. Do đó, việc tạo ra tế bào chondrocytes trên các hạt nhỏ của collagen có thể được sử dụng để khôi phục lại kiểu hình bào trước khi cấy ghép.

Một phương pháp nuôi cấy tế bào sụn lơ lửng trong môi trường lỏng là theo hình thức canh hạt dày đặc của họ, bao gồm các tế bào (0,5-1 * 10 ^b ) thu được bằng cách ly tâm. Sụn như vậy có khả năng sản xuất ma trận có chứa một lượng lớn các proteoglycans, II-collagen type, nhưng không phải loại I collagen, được xác nhận bởi mô học, miễn dịch và phương pháp định lượng.

Ngưng chondrocytes trong ECM tự nhiên

Sụn có thể được nuôi trong hệ thống treo trong một ba chiều ma trận (thạch mềm, agarose, gọi gen gel hoặc bọt biển, axit hyaluronic, fibrin keo, hạt alginate).

Các tế bào hình nang agarose nuôi cấy giữ lại kiểu hình bình thường của chúng và tổng hợp collagen type II và các aggregate tổng hợp đặc biệt cho mô. Khi được nuôi cấy trong môi trường agarose, proteoglycans tổng hợp tế bào được thải ra môi trường trong 50 ngày. Để so sánh - trong nuôi cấy đơn lớp, giai đoạn tế bào đã được lấp đầy với glycosaminoglycans đã có trong 5-6 ngày đầu tiên của sự canh tác; khi trồng trong môi trường sau khi tổng hợp và phóng thích glycosaminoglycans được tăng cường, giảm thời gian trong glycosaminoglycans xảy ra trong 8-10 ngày đầu tiên. Tuy nhiên, hành vi của tế bào chondrocytes trong quá trình nuôi cấy trong agarose khác với điều kiện trong cơ thể. Trong agarose, một số lượng lớn các Aggregan tổng hợp được tổng hợp chứa các phân tử nhỏ hơn và nhỏ hơn so với in vivo. TGF-P kích thích sự tổng hợp proteoglycan trong chất thải, nhưng làm giảm tổng hợp aggrecan trong agarose.

Alginate là một polysaccharide tuyến tính thu được từ rong biển nâu. Với sự có mặt của cation hóa trị hai, như ^{ion Ca2 +}, polymer này trở thành một chất gel. Mỗi sụn bị bắt trong alginate, được bao bọc bởi một ma trận của polysaccharides tích điện âm, các lỗ chân lông trong đó có thể so sánh với những người hủy của sụn. Ma trận được hình thành tế bào sụn trong hạt alginate, bao gồm hai đoạn - một lớp mỏng của ma trận tế bào liên quan tương ứng với ma trận pericellular và lãnh thổ của sụn khớp và nhiều hơn nữa ma trận từ xa tương đương interterritorial trong mô bản xứ. Vào ngày thứ 30 của văn hóa, khối lượng tương đối và tuyệt đối chiếm đóng bởi các tế bào, và mỗi người trong số hai bộ phận trong hạt alginate là gần như hoàn toàn giống với những sụn bản địa. Trong gần 30 ngày sụn giữ lại hình dạng hình cầu của họ và tạo ra aggrecan, tính thủy động lực học mà là tương tự như của các phân tử aggrecan trong ma trận của sụn khớp và collagen phân tử II, IX và XI loại. Cùng lúc đó, giống như các nền văn hóa khác, đình chỉ, hạt alginate trên bề mặt của tế bào dẹt có mặt mà tạo ra một lượng nhỏ loại I collagen phân tử, phát hành trực tiếp vào môi trường và không đưa vào VCR. Trong hạt alginate, sự gia tăng vừa phải của tế bào chondrocytes được quan sát thấy. Sau 8 tháng trồng trọt trong sụn trưởng thành gel alginate không bị mất hoạt động trao đổi chất và tiếp tục tổng hợp mô-cụ thể collagen type II và aggrecan.

N. Tanaka và các đồng tác giả (1984) nghiên cứu tính chất khuếch tán của các phân tử tự nhiên khác nhau trong alginate và nhận thấy rằng các phân tử lớn hơn 70 kD không khuếch tán qua alginate. Do đó, việc trồng các tế bào trong alginate là thích hợp để nghiên cứu các quy định của tổng hợp ma trận và tổ chức của ECM. Sự sẵn có của các tế bào được trồng trong alginate cho phép điều tra tác động của các yếu tố điều tiết peptide và các tác nhân dược lý trên mức độ sao chép, chuyển dịch sau và phiên dịch.

Chondrocytes cũng được nuôi cấy trong một ma trận các loại sợi collagen I và II. S. Nehrer và các đồng tác giả (1997) đã so sánh chức năng của chondrocytes của chó trong các ma trận polymer polyme lỗ khoan có chứa collagens các loại khác nhau. Họ tìm thấy sự khác biệt quan trọng trong hình thái học của chức năng sinh tổng hợp của tế bào chondrocytes nuôi cấy trong các ma trận collagen có chứa collagen loại I và II. Các tế bào trong ma trận collagen type II cuộn hình dạng hình cầu của chúng, trong khi ở collagen type I, chúng có một hình thái dạng nguyên bào sợi. Hơn nữa, trong ma trận của collagen II, tế bào chondrocytes tạo ra nhiều glycosaminoglycans hơn. J. Van Susante và cộng sự (1995) đã so sánh các tính chất của tế bào chondrocytes nuôi cấy trong gel alginate và gel collagen (loại I). Các tác giả đã phát hiện ra sự gia tăng đáng kể về số lượng tế bào trong gel collagen, nhưng từ ngày thứ 6 của quá trình nuôi cấy các tế bào mất một kiểu hình đặc trưng, biến thành những tế bào giống như nguyên bào sợi. Trong gel alginate, số tế bào đã giảm, nhưng các tế bào chondrocytes vẫn giữ lại kiểu hình bình thường của chúng. Lượng proteoglycans gel collagen mỗi tế bào cao hơn trong alginate đáng kể, tuy nhiên mức giảm đã được quan sát trong các yếu tố ma trận gel tổng hợp bắt đầu từ ngày thứ 6 của trồng trọt, trong khi tổng hợp alginate tiếp tục phát triển.

Một ma trận fibrin ba chiều vững chắc là một chất tự nhiên hỗ trợ các tế bào chondrocytes được cân nặng trong nó trong một kiểu hình khác biệt. Ma trận fibrin 3D cũng có thể được sử dụng như một chất mang cho việc cấy ghép xương chondrocyte. Ưu điểm của fibrin là không có độc tính tế bào, khả năng lấp đầy không gian, khả năng dính. Bằng cách nghiên cứu mô học và sinh hóa Autoren-diografii, kính hiển vi điện tử cho thấy tế bào sụn trong gel fibrin giữ lại hình thái của họ, nhân và sản xuất ma trận thậm chí sau 2 tuần tu luyện. Tuy nhiên, G. Homminga và các đồng tác giả (1993) đã báo cáo rằng, sau 3 ngày trồng trọt, sự tan rã của fibrin bắt đầu, việc phân tách chondrocytes diễn ra.

Ngưng chondrocytes trong ECM nhân tạo (tổng hợp)

Có thể thu được cấy ghép sụn cho phẫu thuật tái tạo hoặc chỉnh hình bằng cách phát triển các tế bào chondrocytes bị cô lập trong ống nghiệm trong một ma trận tổng hợp sinh học.

Các tế bào sụn polyglycolic acid nuôi cấy và duy trì hình thái học bình thường và kiểu hình trong vòng 8 tuần. Phức hợp axit chondrocyte-polyglycolic bao gồm các tế bào, glycosaminoglycans, collagens, và có một viên nang collagen ngoài. Tuy nhiên, trong cấy ghép đó có hai loại phân tử collagen - I và II. Cấy ghép từ một loạt các đoạn của tế bào chondrocytes có nhiều glycosaminoglycans và collagen hơn so với cấy ghép từ những tế bào chondrocytes không phân biệt chủ yếu.

L. Freed và các đồng tác giả (1 993b) đã so sánh hành vi của các nền văn hoá con người và bò đực trong axit polyglycolic dạng xơ (HPHC) và trong axit polylactic (PPLC). Sau 6-8 tuần nuôi cấy tăng áp trong HSVG hoặc PPLC, các tác giả đã quan sát sự gia tăng tế bào và tái tạo ma trận sụn. Trong HSBC, các tế bào hình chondrocytes có hình dạng hình cầu, nằm trong vùng ngực bao quanh bởi một ma trận cartilaginous. Sau 8 tuần nuôi cấy in vitro, mô tái sinh có chứa đến 50% chất khô (4% khối lượng tế bào, 15% glycosaminoglycans, và 31% collagen). Trong các tế bào PPLK có hình dạng trục chính, một lượng nhỏ các glycosaminoglycans và collagen. Ở HSBC, tăng trưởng tế bào tăng gấp 2 lần so với PTCA. Trong điều kiện in vivo, tế bào chondrocyte được nuôi cấy trong HPVC và PPLC trong 1 đến 6 tháng sản sinh mô tương tự như sụn mô. Cấy ghép có chứa glycosaminoglycans, loại I và collagen loại II.

Các tế bào chondrocytes đùi của bào thai được nuôi cấy trong polyethylene có tính k hydro nước và hydrophilic mật độ cao. Sau 7 ngày ủ ở cả 2 chất nền, tế bào giữ lại hình cầu, chủ yếu chứa collagen loại II. Sau 21 ngày trồng trọt, hóa ra ma trận ưa nước có chứa nhiều collagen loại II hơn ma trận k hydro nước.

Mô tế bào sụn cũng có thể thu được bằng cách nuôi cấy trong một đơn lớp trên các bộ lọc Millicell-CM. Trước khi phủ các bộ lọc với collagen là cần thiết cho việc gắn bó của chondroits. Khám nghiệm mô học cho thấy sự tích tụ của tế bào chondrocytes trong ECM có chứa proteoglycans và collagen type II. Collagen loại I trong một nền văn hoá như vậy không được phát hiện. Tế bào chondrocytes trong mô sụn có hình dạng hình cầu, nhưng trên bề mặt của mô họ được làm phẳng. Độ dày của mô được hình thành mới tăng lên theo thời gian và phụ thuộc vào mật độ ban đầu của lớp đơn bào. Trong điều kiện nuôi cấy tối ưu, độ dày của mô sụn đạt đến 110 μm, việc tổ chức các tế bào và collagen ở bề mặt và các lớp sâu tương tự với sụn khớp. VKM chứa khoảng 3 lần collagen và proteoglycans. Sau 2 tuần canh tác, sự tích tụ của ma trận-sa đã được ghi nhận, làm cho nó có thể chiết xuất các mô từ bộ lọc và sử dụng nó để cấy ghép.

Sims và cộng sự (1996) đã nghiên cứu việc tạo ra tế bào chondrocytes trong một ma trận polyme đóng gói polyethylene oxide để cho phép một số lượng lớn các tế bào được vận chuyển bằng cách tiêm. Sáu tuần sau khi tiêm vào mô dưới da của chuột nhắt, một sụn mới được hình thành, hình thái học được đặc trưng bởi sự trắng sáng trắng tương tự sụn hyalin. Dữ liệu từ các nghiên cứu mô học và sinh hóa cho thấy sự hiện diện của các tế bào chondrocytes đang phát triển tích cực, sản sinh ECM.

Giải thích

Việc kiểm tra các mô sụn được sử dụng để nghiên cứu các quá trình ana và chuyển hóa trong đó, sự cân bằng, hồi phục và sửa chữa. Chondrocytes trong các mô phân mô sụn hỗ trợ các kiểu hình và thành phần bình thường của ECM, tương tự như trong sụn khớp trong cơ thể. Sau 5 ngày nuôi cấy với sự hiện diện của huyết thanh, đạt được mức tổng hợp liên tục và sự xuống cấp tự nhiên. Tái hấp thu có thể tăng tốc độ nuôi cấy mô và trong văn hóa chính với việc bổ sung huyết thanh sử dụng một số các đại lý, ví dụ, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, các dẫn xuất của acid retinoic hoặc các gốc oxy hoạt động. Để nghiên cứu sửa chữa sụn, thiệt hại của nó là do các chất hòa tan hòa tan hòa tan (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) hoặc vết rạn nứt của ma trận.

Phương pháp nuôi cấy cơ học là một mô hình để nghiên cứu các ảnh hưởng trong ống nghiệm của các yếu tố bên ngoài bị cô lập đối với tế bào chondrocytes và ma trận xung quanh. Trong cơ thể, tế bào chondrocytes hiếm khi nằm trong ECM và không tiếp xúc với nhau. Văn hoá của sụn khớp động vật bị phá hủy giữ lại cơ cấu tổ chức này, cũng như các tương tác đặc biệt giữa các tế bào chondrocytes và môi trường xung quanh của chúng. Mô hình này cũng được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của stress cơ học, các tác nhân dược lý, các yếu tố tăng trưởng, cytokines, hooc môn trên sự chuyển hóa của sụn khớp.

Một ưu điểm khác của việc khai triển mô sụn là không có tổn thương tế bào chondrocyte bởi các enzyme proteolytic hoặc một yếu tố cơ học, điều này là không thể tránh khỏi khi các tế bào được phân lập. Thụ thể và các protein màng và glycoprotein khác được bảo vệ khỏi các yếu tố gây hại.

[26], [27], [28], [29], [30]

Văn hóa của chondrons

Chondron là một đơn vị cấu trúc, chức năng và chuyển hóa của sụn khớp, bao gồm một tế bào chondrocyte, ma sát tế bào và một túi nang sợi nhỏ, và chịu trách nhiệm cho sự cân bằng nội môi của ma trận. Các chondron được chiết xuất bằng cơ học từ sụn và được thu thập bằng một số homogenizations tốc độ thấp liên tiếp. Phân lập từ các khu độ sâu khác nhau sụn hondrony có thể được chia thành bốn loại: hondron duy nhất, hondrony đôi, nhiều (ba hoặc nhiều hơn) hondrony tuyến tính sắp xếp (cột hondronov) tắc nghẽn hondronov.

Các chondron đơn thường được tìm thấy trong các lớp trung gian của sụn nguyên vẹn, được ghép cặp - trên lớp giữa và lớp sâu, các chondron đặt nhiều tuyến tính là điển hình cho các lớp sâu sụn còn nguyên vẹn. Cuối cùng, các chondron bao gồm các nhóm chondron đơn và cặp có tổ chức ngẫu nhiên duy trì trạng thái tổng hợp sau khi đồng nhất hóa. Sự tích tụ của chondrons là những mảnh vỡ lớn của sụn, thường chứa một vài chondrons và các sợi collagen hình tròn, tức là một đặc trưng tổ chức điển hình của các lớp sâu của ma trận. Chondron được cố định trong một agarose trong suốt, cho phép nghiên cứu cấu trúc của chúng, thành phần phân tử và hoạt động trao đổi chất. Hệ thống chondron - agarose được coi là một micromodel của sụn khớp, khác với hệ thống chondrocyte-chiết xuất truyền thống mà môi trường vi mô tự nhiên được duy trì, không cần phải thực hiện quá trình tổng hợp và lắp ráp. Văn hoá của chondrons là một mô hình nghiên cứu sự tương tác của tế bào và ma trận trong sụn khớp trong điều kiện bình thường và bệnh lý.

[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]

Văn hoá của tế bào chondro bất tử

Để tạo ra các dòng tế bào vĩnh cửu, ADN tái tổ hợp hoặc các virut chứa virus có thể tạo ra tế bào "bất tử". Các tế bào chondrocytes bất tử có khả năng phát triển vô tận, duy trì một kiểu hình ổn định. F. Mallein-Gerin et al (1995) đã chỉ ra rằng oncogene là phổ biến vũ khí SV40T gây ra các tế bào sụn chuột mà do đó tiếp tục bày tỏ sự ổn định của Collagen II, IX và XI loại, cũng như protein ràng buộc chung và aggrecan. Tuy nhiên, một dòng tế bào như vậy thu được khả năng tổng hợp collagen loại I khi nuôi cấy trong môi trường đơn lớp hoặc trong gel agarose.

W. Horton và các đồng tác giả (1988) mô tả một dòng các tế bào bất tử có mức biểu hiện mRNA collagen loại II thấp. Các tế bào này thu được bằng cách biến đổi chúng bằng retrovirus chuột có chứa I-myc- và y-ra-oncogenes. Loại tế bào này là một mô hình duy nhất để nghiên cứu các tương tác của ma trận khớp trong trường hợp không có collagen type II, cũng như quy định tổng hợp collagen type II.

Văn hoá chondropytes với gen đột biến hoặc bị xóa là một mô hình thuận tiện để nghiên cứu chức năng sinh lý của chúng. Mô hình này đặc biệt thích hợp cho nghiên cứu vai trò của các phân tử cụ thể trong tổ chức ma trận sụn hoặc nghiên cứu những ảnh hưởng của các yếu tố quy định khác nhau về trao đổi chất sụn. Sụn gen từ xa tổng hợp collagen type IX collagen sợi rộng hơn so với bình thường, chỉ ra rằng loại collagen IX quy định đường kính của sợi. Như tôi đã đề cập ở Chương 1, vừa được tìm thấy gen đột biến COLAI loại mã hóa II collagen trong gia đình có viêm xương khớp tổng quát tiểu học. Nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến collagen type II trong ma trận khớp R. Dharmrvaram et al (1997) thực hiện thâm chuyển ( "ô nhiễm" một axit nucleic nước ngoài) COL khiếm khuyết ₂ AI (arginine ở vị trí 519 được thay thế bằng cysteine) trong tế bào sụn của bào thai của con người trong ống nghiệm.

Hệ thống nuôi cấy ghép. Trong khớp, sụn tương tác với các tế bào của các loại khác có trong màng bám, dịch khớp, dây chằng, xương dưới co. Sự trao đổi chất của tế bào chondrocytes có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố hòa tan được tổng hợp bởi các tế bào này. Vì vậy, viêm khớp khớp sụn bị phá hủy bởi các enzyme proteolytic và các gốc tự do, được tạo ra bởi các tế bào khớp. Do đó, các mô hình đã được phát triển để nghiên cứu sự tương tác phức tạp giữa sụn và các mô xung quanh, được gọi là nuôi cấy.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) là tế bào sụn thỏ nuôi cấy nguyên bào xương và trong hệ thống coculture (bạn diễn), trong đó các tế bào được tách màng microporous (0,4 micron) cho phép việc trao đổi giữa hai loại tế bào mà không cần bất kỳ liên hệ trực tiếp. Nghiên cứu này chứng minh khả năng của nguyên bào xương để kích thích tăng trưởng sụn bởi trung gian hòa tan.

A.M. Malfait và các đồng tác giả (1994) nghiên cứu mối quan hệ giữa bạch cầu đơn bào máu ngoại biên và tế bào chondrocytes. Mô hình này thuận tiện cho việc nghiên cứu các quá trình trung gian bởi các cytokine, trong các bệnh viêm khớp thần kinh (viêm khớp dạng thấp, viêm cột sống huyết thanh âm tính, ...). Các tác giả của mô hình tách các tế bào bằng một màng kết protein với các lỗ có đường kính 0,4 μm. Nghiên cứu phát hiện ra rằng monocytes lipopolysaccharide kích thích làm việc ra iFNO IL-1-a, mà ức chế quá trình tổng hợp của tế bào sụn aggrecan và đóng góp vào sự suy thoái của uẩn aggrecan đã tổng hợp.

K. Tada et al (1994) đã tạo ra một mô hình coculture trong đó các tế bào nội mô trong collagen (I-type) gel được đưa vào buồng bên trong từ buồng bên ngoài tách ra khỏi nó bằng sụn đặt trong một bộ lọc với kích thước lỗ 0,4 micron. Trong một trạng thái cô lập hoàn toàn từ buồng bên ngoài, các tế bào màng trong người hình thành các ống trong gel collagen khi có EGF hoặc TGF-a. Với sự phát triển đồng thời cả hai loại tế bào TGF, sự hình thành phụ thuộc của các ống bởi các tế bào nội mạc đã bị ức chế. Sự ức chế tế bào chondrocyte của quá trình này đã được loại bỏ một phần bởi các kháng thể chống TGF-beta. Có thể giả định rằng TGF-beta được tạo ra bởi các tế bào chondrocytes làm giảm sự vascularization của sụn.

S. Groot và các đồng tác giả (1994) đồng thời nuôi cấy tế bào chondrocytes từ vùng phồng trương và phát triển của xương chuột con 16 ngày tuổi với các mô não. Sau 4 ngày nuôi cấy, quan sát thấy sự hình thành transdifferentiation của xương chondrocytes vào osteoblasts và sự hình thành osteoid. Sau 11 ngày nuôi cấy, một phần của sụn được thay thế bằng mô xương và ma trận xương đã bị vôi hoá một phần. Một số neuropeptides và chất dẫn truyền thần kinh được tạo ra bởi mô não, ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của osteoblasts hoặc có các thụ thể trên chúng. Trong số đó, norepinephrine, peptide đường lactoza, peptide liên quan với gien calcitonin, chất P và somatostatin có thể được phân lập . Cấy với tế bào chondrocytes, mẩu mô não có thể tạo ra một số trong những yếu tố này, có thể gây ra quá trình chuyển đổi tế bào chondrocyte thành xương osteoblasts.

[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]

Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đối với văn hoá của tế bào chondrocytes

Ảnh hưởng của oxy căng thẳng lên sự trao đổi chất của tế bào chondrocytes

Trong hầu hết các trường hợp, các nền văn hoá chondrocyte phát triển trong điều kiện căng thẳng oxy trong khí quyển. Tuy nhiên, người ta cũng biết rằng các tế bào chondrocytes trong cơ thể tồn tại dưới điều kiện thiếu oxy và sự căng thẳng về oxy thay đổi theo các điều kiện bệnh lý khác nhau. Trong quá trình trưởng thành, những thay đổi đáng kể trong việc cung cấp máu của các epiphyses được quan sát thấy. Vì sự vascularization thay đổi ở các vùng khác nhau của mảng tăng trưởng, sự căng thẳng oxy trong chúng cũng thay đổi. C. Brighton và R. Heppenstall (1971) đã chứng minh rằng trong đĩa đệm của xương chày ở thỏ, sự căng thẳng oxy trong vùng phồng trương sẽ thấp hơn so với sụn xung quanh. Đo lường một số thông số chuyển hóa đã chỉ ra rằng các tế bào chondrocytes có thể phản ứng nhanh chóng với sự thay đổi nồng độ oxy tại chỗ. Trước hết, với sự căng thẳng oxy thấp, tiêu thụ của tế bào chondrocytes giảm. Với sự suy giảm oxy từ 21 đến 0,04%, việc sử dụng glucose tăng lên, hoạt động của enzyme glycolysis và tổng hợp axit lactic tăng lên. Ngay cả khi có sự căng thẳng oxy thấp, lượng ATP, ADP và AMP tuyệt đối vẫn ổn định. Những dữ liệu này cho biết hướng của quá trình trao đổi chất chondrocyte để tối đa hóa việc bảo tồn năng lượng. Tuy nhiên, hoạt động tổng hợp, và do đó quá trình bồi thường, thay đổi trong điều kiện thiếu oxy.

Sự căng thẳng oxy cao cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa của tế bào chondrocytes, làm giảm sự tổng hợp proteoglycans và DNA, sự suy giảm của ma trận sụn. Những hiệu ứng này, như một quy luật, đi kèm với việc tạo ra các gốc oxy tự do.

Ảnh hưởng của nồng độ ion và áp suất thẩm thấu của môi trường đối với chức năng của tế bào chondrocytes

Trong nồng độ ion sụn tự nhiên là khác biệt đáng kể so với các mô khác: hàm lượng natri trong môi trường ngoại bào là 250-350 mmoles, và thẩm thấu của nó - 350-450 mOsm. Khi cô lập tế bào sụn từ một VCR và ấp chúng trong một phương tiện truyền thông tiêu chuẩn (DMEM (Essential Medium Minimal Dulbecco - vừa khái quát tối thiểu Dulbecco) thẩm thấu - 250-280,7 mOsm) những thay đổi mạnh xung quanh môi trường của tế bào. Ngoài ra, nồng độ canxi và kali trong môi trường chuẩn thấp hơn nhiều so với mô tự nhiên, và nồng độ anion cao hơn nhiều.

Bổ sung sucroza vào môi trường dẫn đến sự gia tăng sự thẩm thấu của nó và gây ra sự gia tăng nội bào trong sự tập trung H ⁺ và anion canxi trong cytosol. Những thay đổi nội bào như vậy có thể ảnh hưởng đến quá trình phân biệt chondrocyte và hoạt động trao đổi chất của chúng. J. Urban và cộng sự (1993) nhận thấy rằng sự kết hợp của ³⁵⁸ -sulfat và ³ H-proline với các tế bào chẻ bị cô lập được ủ trong môi trường DMEM tiêu chuẩn trong 2-4 giờ chỉ bằng 10% so với mô tế bào gốc. Cường độ tổng hợp lên đến đỉnh điểm khi thẩm thấu của môi trường ngoại bào của 350-400 mOsm trong sụn mới tách và cấy sụn trong. Hơn nữa, thể tích chondrocyte tăng 30-40% sau khi đặt các tế bào bị cô lập trong một môi trường DMEM tiêu chuẩn của độ tinh thể nói trên. Tuy nhiên, khi tế bào sụn nuôi cấy dưới thẩm thấu phi sinh lý cho 12-16 giờ, các tế bào thích nghi với môi trường mới bằng cách giảm cường độ lực cắt là tỷ lệ sinh tổng hợp thẩm thấu của môi trường ngoại bào.

P. Borgetti et al (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ thẩm thấu của môi trường ngoại bào vào sự tăng trưởng, hình thái và sinh tổng hợp của tế bào sụn lợn. Các tác giả đã chứng minh đặc điểm sinh hóa và hình thái tương tự của tế bào sụn nuôi cấy trong môi trường với độ thẩm thấu mOsm 0,28 và 0,38. Khi 0,48 mOsm thẩm thấu của môi trường trong thời gian 4-6 giờ đầu tiên của văn hóa được quan sát thấy giảm sự tăng sinh tế bào và tổng hợp protein, nhưng sau đó xảy ra khôi phục các thông số mà cuối cùng đạt đến giá trị kiểm soát. Khi nuôi cấy tế bào sụn trong một môi trường với các tế bào thẩm thấu 0,58 mOsm mất khả năng để hỗ trợ quá trình tăng sinh cường sinh lý và sau 6 ngày số lượng tế bào sụn được giảm đáng kể. Với osmolarity của môi trường, 0,58 mosmol, một sự ức chế sâu của tổng hợp protein được quan sát thấy. Ngoài ra, khi nuôi cấy trong môi trường với độ thẩm thấu mOsm 0,28-0,38 sụn giữ lại kiểu hình sinh lý ở độ thẩm thấu cao hơn (mOsm 0,48-0,58) thay đổi đáng kể về hình thái tế bào, như mất được biểu hiện đặc trưng kiểu hình tế bào sụn chuyển đổi vào các tế bào da nguyên bào sợi, cũng như mất tế bào, khả năng lắp ráp proteoglycans ma trận. Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy sụn đáp ứng với những biến động trong độ thẩm thấu hạn chế về môi trường ngoại bào.

Sự thay đổi nồng độ các ion khác cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp sinh học trong các tế bào chondrocytes. Vì vậy, mức độ bao gồm ³⁵ S (sulfate) tăng một nửa với sự gia tăng nồng độ ion kali từ 5 mmol (nồng độ trong môi trường DM DM chuẩn) đến 10 mmol (nồng độ trong VKM in vivo). Nồng độ canxi dưới 0,5 mmol đã góp phần tạo ra collagen bằng các tế bào sụn bò trưởng thành, trong khi đó hàm lượng 1-2 mmol (tương ứng với nồng độ trong môi trường DM DM chuẩn) đã làm giảm đáng kể sự tổng hợp collagen. Sự gia tăng vừa phải trong tổng hợp sinh học đã được quan sát thấy ở hàm lượng canxi cao (2-10 mmol). Các cation khác nhau tham gia vào việc gắn các tế bào chondrocytes vào protein VKM. Do đó, ion magiê và mangan cung cấp sự gắn bó với fibronectin và collagen loại II, trong khi các ion canxi không tham gia vào việc gắn các tế bào chondrocytes vào protein. Do đó, kết quả của các nghiên cứu đã chỉ ra ảnh hưởng của sự thay đổi ion ngoại bào của kali, natri, canxi và osmolarity của môi trường trên chức năng sinh tổng hợp của tế bào chondrophy được ủ trong môi trường chuẩn.

Ảnh hưởng của áp suất cơ học đối với quá trình chuyển hóa của tế bào chondrocytes

Sự cố định của khớp gây ra sự teo nhanh của sụn, cho thấy cần phải kích thích cơ cho quá trình chuyển hóa thông thường trong ECM. Trong hầu hết các trường hợp, các mô hình nuôi cấy tế bào đã tồn tại dưới các điều kiện áp suất bình thường trong khí quyển. M. Wright và các đồng tác giả (1996) cho thấy môi trường cơ học ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào chondrocytes, phản ứng của các tế bào phụ thuộc vào cường độ và tần suất tải nén. Các thí nghiệm với việc bốc hàng trên các ống nghiệm của sụn khớp động mạch nguyên thủy trong ống nghiệm chứng minh sự giảm tổng hợp protein và proteoglycan trong hoạt động của tải tĩnh, trong khi năng động kích thích các quá trình này. Cơ chế chính xác để xác định tác động của tải cơ học đối với sụn là phức tạp và có thể liên quan đến biến dạng tế bào, áp suất thủy tĩnh, áp suất thẩm thấu, điện thế và các thụ thể tế bào bề mặt đối với các phân tử ma trận. Để nghiên cứu hiệu quả của từng tham số này, cần tạo ra một hệ thống trong đó một tham số có thể được thay đổi độc lập. Ví dụ, một nền văn hoá khai thác không thích hợp để nghiên cứu biến dạng tế bào, nhưng nó có thể được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng tổng thể của áp lực lên hoạt động trao đổi chất của tế bào chondrocytes. Sự nén của sụn dẫn đến sự biến dạng của tế bào, và kèm theo sự xuất hiện của một gradient áp lực thủy tĩnh, tiềm năng điện, lưu lượng chất lỏng và sự thay đổi các tham số hóa lý như hàm lượng nước trong ma trận, mật độ điện tích, và áp suất thẩm thấu. Sự biến dạng tế bào có thể được nghiên cứu bằng cách sử dụng những tế bào chondrocytes bị cô lập trong gel agarose hoặc collagen.

Một số hệ thống đã được phát triển để nghiên cứu tác động kích thích cơ học đối với việc nuôi cấy tế bào. Một số nhà nghiên cứu sử dụng các hệ thống cho mục đích này, trong đó áp lực được áp dụng cho nuôi cấy tế bào thông qua pha khí. Ví dụ, JP Veldhuijzen et al (1979) sử dụng một áp lực trên khí quyển của 13 kPa ở một tần số thấp (0,3 Hz) trong thời gian 15 phút, quan sát thấy sự gia tăng trong tổng hợp cAMP và proteoglycans và giảm tổng hợp DNA. R. Smith et al (1996) cho thấy rằng việc tiếp xúc liên tục của nền văn hóa chủ yếu của tế bào sụn bò áp suất thủy tĩnh (10 MPa) tại 1 Hz trong vòng 4 giờ gây ra sự gia tăng của quá trình tổng hợp của aggrecan và collagen type II, trong khi áp lực liên tục không hề ảnh hưởng đến các quá trình này. Sử dụng một hệ thống tương tự M. Wright et al (1996) báo cáo rằng áp lực theo chu kỳ trên nuôi cấy tế bào có liên quan đến sự tăng phân cực của màng tế bào của tế bào sụn và kích hoạt của Ca ²⁺ kênh kali -dependent. Do đó, ảnh hưởng của áp suất tuần hoàn được trung gian bởi các kênh ion, được kích hoạt bởi sự giãn nở, trong màng tế bào chondrocyte. Sự đáp ứng của tế bào chondrocytes đối với áp suất thủy tĩnh phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy tế bào và tần suất tải đã áp dụng. Do đó, áp lực thủy tĩnh theo chu kỳ (5 MPa) làm giảm sự kết hợp của sulfate vào sụn đơn lớp ở một tần số là 0,05, 0,25 và 0,5 Hz, trong khi đối với các tần số trên 0,5 Hz bao gồm sulfat trong sụn cấy tăng.

Bushmann M. Et al (1992) báo cáo rằng tế bào sụn trong gel agarose ông thay đổi sinh tổng hợp để đáp ứng với tải cơ khí tĩnh và động cũng như trồng organ còn nguyên vẹn. Các tác giả nhận thấy rằng tải cơ học tạo ra một kích thích tăng áp, tiếp theo là sự giảm pH trong các tế bào chondrocytes.

Tác động của sự kéo dài cơ học có thể được nghiên cứu trên một nền văn hoá các tế bào được đắm trong gel. Các lực kéo có thể được tạo ra bằng cách sử dụng một máy tính kiểm soát chân không. Khi hệ thống đang ở trong một mức độ nhất định chân không, dưới cùng của một đĩa Petri với một nền văn hóa của các tế bào được mở rộng bởi một khoản tiền gọi, một biến dạng tối đa ở các cạnh của đáy cốc và tối thiểu tại trung tâm. Kéo dài được truyền và nuôi cấy trong một đĩa petri của bánh chondrocytes. Với phương pháp này, Holm-Vall K. Et al (1995) đã chỉ ra rằng nuôi trong collagen (II type) các tế bào sụn gel tăng sự biểu hiện của mRNA và ₂ -integrina. Một ₂ p _r integrin có khả năng liên kết với collagen type II. Nó được coi là mechanoreceptors vì nó tương tác với protein aktinsvyazyvayuschimi, do đó kết nối VCR và khung tế bào.

Ảnh hưởng của pH lên tính chuyển hóa của tế bào chondrocyte

Độ pH của dịch kẽ của ECM của mô sụn có tính axit hơn các mô khác. A. Maroudas (1980) xác định độ pH của sụn khớp ở 6,9. W. Diamant và các đồng tác giả (1966) đã phát hiện ra độ pH 5.5 trong điều kiện bệnh lý. Người ta biết rằng tế bào chondrocytes sống ở PO2 thấp, điều này cho thấy vai trò quan trọng của glycolysis (95% tổng số chuyển hóa glucose) trong quá trình trao đổi chất của các tế bào này; glycolysis đi kèm với việc sản xuất một lượng lớn axit lactic.

Ngoài việc axit hóa môi trường bằng các sản phẩm của glycolysis, các thành phần ma trận cũng rất quan trọng. Một số lượng lớn các điện tích âm cố định trên proteoglycans ngoại bào làm thay đổi thành phần ion: có một nồng độ cao của các cation miễn phí (ví dụ H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) và nồng độ thấp của các anion (ví dụ, O2, NPHS). Ngoài ra, dưới ảnh hưởng của tải cơ học, nước được loại bỏ khỏi ECM, làm tăng nồng độ các điện tích âm cố định và thu hút nhiều cation hơn vào ma trận. Điều này đi cùng với sự giảm pH của môi trường ngoại bào, ảnh hưởng đến pH trong tế bào, qua đó làm thay đổi sự chuyển hóa của tế bào chondrocytes. R. Wilkin và A. Hall (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH của môi trường ngoại bào và nội bào trong quá trình sinh tổng hợp của ma trận bởi các tế bào chondroxy hình thành. Họ quan sát một sự thay đổi kép của tổng hợp ma trận với sự giảm pH. Một sự giảm nhẹ trong pH (7,4 35 S0 ₄ và ³ H-prolin thành tế bào sụn, trong khi axit hóa sâu hơn (pH <7,1) ức chế quá trình tổng hợp bằng 75% so với kiểm soát. Tạo độ pH thấp (6.65) bằng ion amoni làm giảm tổng hợp ma trận chỉ bằng 20%. Kết quả thu được chỉ ra rằng sự biến đổi của pH của môi trường tổng hợp ma trận ngoại bào không thể giải thích chỉ bằng sự thay đổi độ pH của môi trường trong tế bào. Bên cạnh đó, tế bào sụn có khả năng điều chỉnh độ pH trong tế bào bởi Na ⁺, H ⁺ trao đổi, Ca ⁺ -dependent C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS và H ⁺ / ATPase.

[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]

Ảnh hưởng của thành phần của môi trường lên men đối với quá trình chuyển hóa của tế bào chondrocytes

Môi trường nuôi cấy tế bào chondrocytes phải tương ứng với điều kiện thực nghiệm. Trong những năm gần đây, huyết thanh bê đã được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên, khi sử dụng huyết thanh, phải cân nhắc một số điểm quan trọng:

• sự phát triển bên ngoài của các tế bào từ ngoại vi của mô trong nuôi cấy cơ quan,
• sự biến đổi của thành phần huyết thanh của các chuỗi khác nhau,
• sự hiện diện của các thành phần không rõ trong chúng,
• tăng nguy cơ can thiệp, hiện vật trong nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố sinh học khác nhau lên hoạt động trao đổi chất của tế bào.

Một ví dụ của nghiên cứu này là nghiên cứu về hiệu quả của EGF đối với chondrocytes sụn ở chuột. EGF kích thích kết hợp của ³ H-thymidine và tăng hàm lượng ADN trong văn hóa. Tác dụng này rõ rệt hơn ở nồng độ huyết thanh thấp (<1%), nhưng ở nồng độ cao (> 7,5%) ảnh hưởng đã biến mất.

Nồng độ tổng hợp và sự xuống cấp trong DMEM được làm giàu bằng huyết thanh bê tăng đáng kể so với điều kiện in vivo. Sự khác nhau giữa sự trao đổi chất trong cơ thể và trong ống nghiệm có thể do sự khác nhau giữa dịch khớp và môi trường trong đó tế bào được nuôi cấy. D. Lee et al (1997) là tế bào sụn nuôi con bò đực tơ agarose sử dụng một môi trường dinh dưỡng chứa DMEM, làm giàu với 20% huyết thanh bê và một số lượng lớn các chất lỏng hoạt dịch bình thường đồng loại. Sự hiện diện của dịch khớp trong môi trường đã làm tăng số lượng proteoglycan, lên đến 80% tổng lượng chất dịch khớp. Các kết quả thu được chỉ ra rằng dịch khớp trong nuôi cấy tạo ra một tỷ lệ trao đổi chất tương tự như trong cơ thể, với một mức độ tổng hợp glycosaminoglycan cao và mức độ phân chia tế bào thấp.

G. Verbruggen et al (1995) đã chỉ ra rằng sự tổng hợp của ³⁵ S-arrpeKaHa sụn nhân nuôi trong agarose trong DMEM mà không huyết thanh là 20-30% của mức độ tổng hợp được quan sát trong DMEM, bổ sung với 10% huyết thanh bê. Các tác giả xác định mức độ mà tại đó IGF-1, IGF-2, TGF-P hoặc giảm aggrecan sản xuất insulin trong môi trường không huyết thanh. Các tác giả kết luận rằng 100 ng / ml insulin, IGF-1 hoặc IGF-2 giảm một phần tổng hợp của aggrecan tới 39-53% của mức kiểm soát. Với sự kết hợp của các yếu tố này, không có hiện tượng hiệp đồng hoặc tích lũy nào được xác định. Đồng thời, 10 ng / ml TGF-P trong sự hiện diện của 100 ng insulin / ml kích thích tổng hợp aggrecan đến 90% hoặc nhiều hơn mức tham chiếu. Cuối cùng, transferrin huyết thanh, đơn thuần hoặc kết hợp với insulin, không ảnh hưởng đến sự tổng hợp của aggrecan. Khi huyết thanh bê được thay thế bằng albumin huyết thanh bò, tổng hàm lượng aggrecan giảm đáng kể. Làm giàu môi trường nuôi cấy với insulin, IGF, hoặc TGF-P là một phần phục hồi khả năng của các tế bào để sản xuất uẩn aggrecan. Trong trường hợp này, IGF-1 và insulin có thể duy trì sự cân bằng nội môi trong nuôi cấy tế bào. Sau 40 ngày nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 10-20 ng / ml IGF-1, tổng hợp proteoglycan được duy trì ở mức tương tự hoặc thậm chí cao hơn so với trung bình chứa 20% huyết thanh bê. Quá trình dị hóa tiến chậm trong môi trường bổ sung với IGF-1 hơn trong môi trường bổ sung bằng dung dịch albumin 0,1%, nhưng hơi nhanh hơn trong môi trường có bổ sung 20% huyết thanh. Ở các nền văn hoá sống lâu dài, 20 ng / ml IGF-1 duy trì một trạng thái ổn định của tế bào.

D. Lee et al (1993) đã so sánh ảnh hưởng của các thành phần của môi trường nuôi cấy (DMEM, DMEM + 20% bê huyết thanh, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) trên tổng hợp DNA trong một nền văn hóa của sụn mẫu cấy, nuôi cấy đơn lớp và trong hệ thống treo trong agarose . Khi nuôi cấy trong agarose trong sự hiện diện của tác giả trong huyết thanh quan sát xu hướng nhóm các tế bào sụn ở nồng độ lớn. Tế bào nuôi cấy mà không huyết thanh và với IGF1, giữ lại một hình tròn trong agarose, được thu thập trong các nhóm nhỏ, nhưng đã không thành uẩn lớn. Trong đơn lớp tổng hợp DNA là cao hơn đáng kể trong môi trường huyết thanh có chứa hơn trong môi trường bổ sung với IGF-1; Sự tổng hợp DNA ở giai đoạn sau cao hơn nhiều so với môi trường chưa được làm giàu. Khi nuôi cấy tế bào sụn trong hệ thống treo trong agarose trong môi trường unconcentrated và trong một môi trường với IGF-1, có sự khác biệt trong tổng hợp DNA. Đồng thời bùn nuôi cấy tế bào sụn trong agarose trong môi trường bổ sung huyết thanh, được hộ tống bởi một kết hợp tăng radionucleotide ³ H-thymidine so với các môi trường khác.

Vitamin C là cần thiết cho sự kích hoạt của các enzym tham gia vào sự hình thành của một cấu trúc xoắn ốc ổn định của collagen fibrils. Các tế bào chondrocytes, thiếu hụt ascorbic acid, tổng hợp các tiền chất không collagen dưới da không hydroxy hóa, đang dần được tiết ra. Việc bổ sung axit ascorbic (50 μg / ml) gây ra sự hydroxyl hóa collagen loại II và IX và sự bài tiết của chúng với lượng thông thường. Việc bổ sung vitamin C không ảnh hưởng đến mức độ tổng hợp proteoglycans. Do đó, bài tiết của collagen được điều chỉnh độc lập với sự tiết của proteoglycans.

[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64], [65]