Mô hình thực nghiệm của bệnh thoái hóa khớp

Sụn là một mô chuyên biệt cao chỉ chứa một loại tế bào (tế bào sụn) và đặc trưng bởi sự vắng mặt của mạch máu và mạch bạch huyết. Sụn chủ yếu được nuôi dưỡng bằng sự hấp thụ từ dịch hoạt dịch. Quá trình chuyển hóa của tế bào sụn được điều chỉnh bởi một số yếu tố hòa tan được sản xuất tại chỗ bởi tế bào sụn và các mô xung quanh. Chức năng của tế bào sụn cũng phụ thuộc vào thành phần của môi trường ngoại bào (độ căng oxy, nồng độ ion, độ pH, v.v.), thành phần của ECM, sự tương tác giữa các tế bào và ma trận, và các tín hiệu vật lý. Mục tiêu chính của mô hình thực nghiệm là tạo ra các nền văn hóa trong môi trường ngoại bào mà không làm thay đổi kiểu hình của các tế bào trưởng thành. Mục tiêu thứ hai là tạo ra các nền văn hóa để nghiên cứu phản ứng sớm, chậm trễ, ngắn hạn hoặc kéo dài của tế bào sụn đối với các tín hiệu hóa học và/hoặc vật lý. Các nghiên cứu trong ống nghiệm cũng cung cấp cơ hội để nghiên cứu hành vi của tế bào sụn trong bệnh thoái hóa khớp. Mục tiêu thứ ba là phát triển các hệ thống đồng nuôi cấy cho phép nghiên cứu sự tương tác của các mô khác nhau trong khớp. Nhiệm vụ thứ tư là chuẩn bị các mô cấy ghép sụn để cấy ghép sau đó. Và cuối cùng, nhiệm vụ thứ năm là nghiên cứu các yếu tố tăng trưởng, cytokine hoặc tác nhân điều trị có khả năng kích thích phục hồi và/hoặc ức chế sự tiêu sụn.

Trong những thập kỷ qua, nhiều mô hình nuôi cấy tế bào sụn khớp đã được tạo ra, bao gồm nuôi cấy đơn lớp, nuôi cấy treo, nuôi cấy sụn, explants, cocultures và nuôi cấy tế bào bất tử. Mỗi nuôi cấy đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và mỗi nuôi cấy đều phù hợp để nghiên cứu một khía cạnh cụ thể của quá trình chuyển hóa tế bào sụn. Do đó, explants sụn là một mô hình tuyệt vời để nghiên cứu sự thay đổi của các thành phần ma trận, đòi hỏi các thụ thể bề mặt tế bào thực sự và tương tác tế bào-ma trận và ma trận-tế bào bình thường. Đồng thời, nên nghiên cứu các chất lắng đọng ma trận hoặc cơ chế điều chỉnh quá trình chuyển hóa tế bào sụn trên nuôi cấy các tế bào riêng lẻ. Nuôi cấy đơn lớp mật độ thấp là cần thiết để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào. Nuôi cấy treo trong ma trận tự nhiên hoặc tổng hợp là một mô hình để phân tích phản ứng thích nghi của tế bào sụn đối với ứng suất cơ học.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Nuôi cấy tế bào sụn

Một số điểm quan trọng cần lưu ý khi lựa chọn mô sụn cho các nghiên cứu trong ống nghiệm. Thành phần ma trận và hoạt động trao đổi chất của tế bào sụn khác nhau giữa các khớp, và hoạt động trao đổi chất cũng phụ thuộc vào độ sâu của vị trí tế bào sụn trong mô. Những dữ liệu này thu được trong một số thí nghiệm trong đó các phân nhóm tế bào sụn được phân lập từ các vùng sụn có độ sâu khác nhau được nghiên cứu. Một số khác biệt về hình thái và sinh hóa đã được tìm thấy giữa các tế bào sụn nuôi cấy nằm ở các lớp nông và sâu của sụn khớp. Các tế bào nông tổng hợp một ma trận sợi thưa thớt, nghèo proteoglycan, trong khi các tế bào sâu hơn tạo ra một ma trận giàu sợi và proteoglycan. Hơn nữa, các tế bào nông tạo ra tương đối nhiều proteoglycan nhỏ không kết tụ và axit hyaluronic và tương đối ít aggrecan và keratan sulfate hơn so với các tế bào sụn sâu hơn. Một đặc điểm quan trọng khác biệt của quá trình trao đổi chất của tế bào sụn được phân lập từ các vùng sụn có độ sâu khác nhau là phản ứng với kích thích ngoại sinh. Theo M. Aydelotte và cộng sự, tế bào sụn bò từ vùng sụn nông nhạy cảm hơn với IL-1 so với tế bào từ vùng sâu.

Hành vi của tế bào cũng phụ thuộc vào vị trí mô. Các tế bào sụn từ sụn sườn và sụn tai của cùng một loài động vật phản ứng khác nhau với các yếu tố tăng trưởng như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) và TGF-beta. FGF làm tăng sự kết hợp thymidine, proline và leucine vào xương sườn nuôi cấy nhưng không phải là tế bào sụn tai. TGF-beta làm tăng sự kết hợp thymidine vào các tế bào sụn sườn và sụn tai nhưng không có tác dụng đối với sự kết hợp thymidine và proline vào các tế bào sụn tai. Các tế bào sụn từ các vùng chịu áp lực cao khác với các tế bào từ các vùng chịu áp lực thấp trên sụn. Do đó, các tế bào sụn của sụn khớp gối cừu trưởng thành từ vùng trung tâm của bề mặt khớp xương chày không được bao phủ bởi sụn chêm, chịu tải trọng lớn nhất trong cơ thể sống, tổng hợp ít aggrecan hơn nhưng nhiều decorin hơn các tế bào từ các vùng được bao phủ bởi sụn chêm. Các tác giả cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng sụn từ các vùng khớp giống hệt nhau khi nghiên cứu chức năng tổng hợp của khớp.

Quá trình chuyển hóa của tế bào sụn và phản ứng của chúng với các yếu tố điều hòa cũng phụ thuộc đáng kể vào độ tuổi của người hiến tặng, sự phát triển của bộ xương và tình trạng của các khớp mà tế bào được lấy ra. Ở tế bào sụn của người, phản ứng tăng sinh giảm đáng kể theo tuổi tác. Sự giảm lớn nhất được quan sát thấy ở những người hiến tặng trong độ tuổi 40-50 và trên 60 tuổi. Hơn nữa, mức độ nghiêm trọng của phản ứng tăng sinh đối với các yếu tố tăng trưởng (ví dụ, FGF và TGF-beta) giảm dần theo tuổi tác. Ngoài những thay đổi về số lượng trong quá trình tăng sinh tế bào sụn, còn có những thay đổi về chất lượng. Các tế bào từ những người hiến tặng trẻ (10-20 tuổi) phản ứng tốt hơn với yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF) so với TGF-beta, trong khi ngược lại được quan sát thấy ở các tế bào từ những người hiến tặng trưởng thành. Một số cơ chế được sử dụng để giải thích những thay đổi phụ thuộc vào độ tuổi trong chức năng tổng hợp của tế bào sụn và phản ứng của chúng với các yếu tố tăng trưởng. Những điều này bao gồm sự giảm số lượng và ái lực của các thụ thể tế bào bề mặt, những thay đổi trong quá trình tổng hợp và hoạt tính sinh học của các yếu tố tăng trưởng và cytokine, và sự biến đổi các tín hiệu sau thụ thể.

Tình trạng bệnh lý của khớp cũng làm thay đổi hình thái và hoạt động chuyển hóa của tế bào sụn. Do đó, J. Kouri và cộng sự (1996) đã xác định được ba phân nhóm tế bào sụn trong sụn ở bệnh thoái hóa khớp. Tế bào sụn từ phần nông và phần trên của giữa sụn tạo thành các cụm và tổng hợp một lượng lớn proteoglycan và collagen. TGF-beta và yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF) có khả năng kích thích tế bào sụn tổng hợp proteoglycan và trung hòa một phần tác dụng của IL-1 và TNF-α. Các mẫu cấy ghép sụn bị ảnh hưởng bởi bệnh thoái hóa khớp và tế bào sụn được phân lập từ sụn của bệnh nhân bị thoái hóa khớp nhạy cảm hơn với sự kích thích của TGF-beta so với tế bào sụn của sụn khỏe mạnh. Những khác biệt này rất có thể liên quan đến những thay đổi về kiểu hình ở tế bào sụn ở các lớp trên của sụn khớp.

Việc phân lập các tế bào sụn riêng lẻ đạt được bằng cách xử lý tuần tự ECM bằng các enzyme phân giải protein. Sau khi được giải phóng khỏi ECM, các tế bào được phân lập là lý tưởng để nghiên cứu quá trình tổng hợp de novo các thành phần của ma trận. Một số tác giả chỉ sử dụng collagenase clostridial, trong khi những tác giả khác ủ trước sụn với trypsin, pronase, DNase và/hoặc hyaluronidase. Số lượng tế bào được phân lập phụ thuộc vào các enzyme được sử dụng. Do đó, khi chỉ xử lý bằng collagenase, có thể thu được 1,4-106 ^tế bào sụn từ 1 g mô, trong khi sử dụng pronase, hyaluronidase và collagenase - 4,3-106 ^. Khi được xử lý bằng collagenase, aggrecan, protein, IL-6 và IL-8 vẫn tồn tại trong nuôi cấy tế bào với số lượng lớn hơn đáng kể so với xử lý tuần tự bằng các enzyme khác nhau. Có một số giải thích cho những khác biệt này giữa hai nuôi cấy tế bào:

• Các thụ thể tế bào bị hư hỏng hoặc bị ức chế bởi các enzyme, TGF-beta ức chế sự tổng hợp DNA và proteoglycan trong các tế bào sụn mới phân lập (ngày 1), trong khi sự tổng hợp DNA và proteoglycan trong các tế bào sụn được nuôi cấy trong một lớp đơn (7 ngày) được kích thích bởi TGF-beta. Tuy nhiên, cần có một khoảng thời gian thích hợp để tái biểu hiện các thành phần màng này trước khi bắt đầu thí nghiệm.
• Protease ngoại sinh có thể phá vỡ tương tác tế bào-ma trận do integrin làm trung gian. Họ integrin thúc đẩy sự gắn kết của tế bào sụn với các phân tử ECM (Shakibaei M. et al., 1997). Sự phá vỡ này có thể ảnh hưởng đến biểu hiện của gen ma trận.
• Các thành phần còn lại của ma trận có thể điều chỉnh chức năng tổng hợp của tế bào sụn. Integrin có khả năng nhận biết các sản phẩm phân hủy ECM, do đó đóng vai trò quan trọng trong việc phục hồi mô sau tác động của các enzyme phân giải protein. T. Larsson và cộng sự (1989) đã báo cáo rằng việc bổ sung proteoglycan nguyên vẹn hoặc phân mảnh vào nuôi cấy tế bào kích thích quá trình tổng hợp protein và proteoglycan. Tuy nhiên, nồng độ axit hyaluronic cao gây ra sự giảm đáng kể sự bao gồm các sulfat trong quá trình tổng hợp proteoglycan của tế bào sụn phôi gà, tế bào sụn trưởng thành của lợn và tế bào sụn sarcoma chuột. Hơn nữa, axit hyaluronic là chất ức chế giải phóng proteoglycan từ tế bào ngay cả khi có sự hiện diện của IL-1b, TNF-a, FGF, cho thấy sự đối kháng của hoạt động sinh học đầu tiên của các yếu tố tăng trưởng và cytokine. Cơ chế chính xác đằng sau tác động của axit hyaluronic vẫn chưa rõ ràng; Người ta biết rằng tế bào sụn có chứa một thụ thể axit hyaluronic liên kết với các sợi actin của tế bào chất. Sự liên kết của axit hyaluronic với thụ thể của nó kích thích sự phosphoryl hóa protein. Do đó, dữ liệu này chứng minh sự điều biến chức năng chuyển hóa của tế bào sụn bằng các phân tử protein ma trận phân mảnh hoặc tự nhiên thông qua sự kích hoạt của các thụ thể màng tế bào.
• Sự kích thích nhanh chóng quá trình tổng hợp protein ma trận của tế bào sụn bằng enzyme có thể là hậu quả của những thay đổi về hình dạng tế bào sụn và/hoặc sự tái tổ chức bộ xương tế bào.
• Một số cytokine (ví dụ, IL-8) và các yếu tố tăng trưởng (ví dụ, IGF-1, TGF-β) được cô lập trong ECM. Ví dụ nổi tiếng nhất là sự liên kết của TGF-β với decorin, dẫn đến khả năng giảm của TGF-β trong việc kích thích tăng trưởng tế bào ở tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc. Phát hiện rằng hàm lượng decorin trong sụn tăng theo tuổi cho thấy khả dụng sinh học của TGF-β giảm theo tuổi tác. Các yếu tố tăng trưởng và cytokine có thể được giải phóng từ các mảnh vỡ của ma trận trong quá trình nuôi cấy và sau đó điều chỉnh chức năng của tế bào sụn.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Nuôi cấy tế bào sụn đơn lớp

Kiểu hình biệt hóa của tế bào sụn chủ yếu được đặc trưng bởi sự tổng hợp collagen loại II và proteoglycan đặc hiệu mô, cũng như mức độ hoạt động nguyên phân thấp. Có bằng chứng cho thấy khi nuôi cấy tế bào kéo dài trong một lớp đơn, cũng như sau nhiều lần truyền tế bào lặp đi lặp lại, tế bào sụn mất đi đường viền hình cầu và có được hình dạng giống nguyên bào sợi kéo dài. Với quá trình chuyển sản nguyên bào sợi như vậy, chức năng tổng hợp của tế bào cũng bị thay đổi, đặc trưng bởi sự giảm dần quá trình tổng hợp collagen loại II, IX và XI và sự gia tăng quá trình tổng hợp collagen loại I, III và Y. Các proteoglycan nhỏ không kết tụ được tổng hợp do aggrecan chức năng. Sự tổng hợp cathepsin B và L cực kỳ thấp trong các tế bào biệt hóa, nhưng tăng lên trong quá trình mất biệt hóa. Collagenase-1 được biểu hiện trong tế bào sụn biệt hóa; khi nuôi cấy kéo dài, biểu hiện của nó giảm đi, trong khi sản xuất chất ức chế mô của metalloprotease (TIMP) tăng lên.

Tế bào sụn biệt hóa tái biểu hiện collagen của kiểu hình biệt hóa khi chuyển từ lớp đơn sang nuôi cấy treo. Quá trình biệt hóa có thể liên quan đến hình dạng tế bào. Tính chất này thường được các nhà nghiên cứu sử dụng khi nghiên cứu các ghép khiếm khuyết với tế bào sụn tự thân. Một số lượng nhỏ tế bào thu được từ vật liệu sinh thiết có thể được mở rộng trong nuôi cấy lớp đơn và sau đó được đưa trở lại vào ma trận ba chiều trước khi cấy ghép. Sự tái biểu hiện của kiểu hình cụ thể của tế bào sụn khử biệt hóa được chuyển sang nuôi cấy agarose có thể được kích thích bởi TGF-β, phức hợp ossein-hydroxyapatite và axit ascorbic.

Để đáp ứng với các yếu tố tăng trưởng và cytokine, các tế bào sụn được biến đổi trong quá trình biệt hóa. Phản ứng của tế bào đối với các cytokine và các yếu tố tăng trưởng khác nhau giữa các tế bào sụn chưa biệt hóa và đã biệt hóa. IL-1 kích thích sự tăng sinh nguyên bào sợi, trong khi sự phát triển của các tế bào sụn chưa biệt hóa bị ức chế bởi IL-1. Tổng hợp DNA được kích thích bởi IGF-1 trong các tế bào sụn dài nhưng không dẹt. Ở các tế bào sụn đã biệt hóa, tác dụng kích thích của IL-1beta và TNF-a đối với sản xuất procollagenase rõ rệt hơn so với ở các tế bào sụn chưa biệt hóa.

Nuôi cấy tế bào sụn

Nuôi cấy tế bào sụn trong môi trường lỏng hoặc trong ma trận ba chiều tự nhiên hoặc tổng hợp giúp ổn định kiểu hình của tế bào sụn. Các tế bào vẫn giữ nguyên hình cầu và tổng hợp các protein đặc hiệu của mô. Nuôi cấy tế bào sụn trong môi trường lỏng thường được khuyến nghị để nghiên cứu quá trình hình thành ma trận quanh tế bào mới. Nuôi cấy tế bào sụn trong polyme hấp thụ tổng hợp hoặc tự nhiên được sử dụng để cấy ghép tế bào vào các khiếm khuyết sụn nhằm kích thích tái tạo mô sụn khớp. Môi trường tổng hợp hoặc tự nhiên để cấy ghép tế bào phải đáp ứng một số yêu cầu sau:

• cấy ghép phải có cấu trúc xốp để tế bào bám dính và phát triển,
• bản thân polyme cũng như các sản phẩm phân hủy của nó không gây viêm hoặc phản ứng độc hại khi cấy ghép vào cơ thể sống,
• vật mang ghép phải có khả năng liên kết với sụn liền kề hoặc xương dưới sụn,
• ma trận tự nhiên hoặc tổng hợp phải có khả năng hấp thụ, sự phân hủy của nó phải được cân bằng bởi sự tái tạo mô,
• để tạo điều kiện cho việc sửa chữa sụn, cấu trúc hóa học và kiến trúc lỗ chân lông của ma trận phải tạo điều kiện cho việc duy trì kiểu hình tế bào và tổng hợp các protein đặc hiệu của mô bởi các tế bào sụn được đặt trong đó,
• Trong quá trình cấy ghép in vivo, cần phải nghiên cứu các tính chất cơ học của chất nền tổng hợp hoặc tự nhiên.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Treo tế bào sụn trong pha lỏng

Sự bám dính của các tế bào vào các mạch nhựa trong đó nuôi cấy tế bào sụn có thể được ngăn ngừa bằng cách phủ lên thành của chúng một dung dịch methylcellulose, agarose, hydrogel (poly-2-hydroxyethyl methacrylate) hoặc hỗn hợp collagen-agarose. Trong những điều kiện này, tế bào sụn tạo thành các cụm và tổng hợp chủ yếu là aggrecan và collagen đặc hiệu mô (loại II, IX, XI). Thường có hai loại tế bào. Các tế bào nằm ở trung tâm vẫn giữ hình cầu và được bao quanh bởi một ECM phát triển tốt, điều này được xác nhận bằng các nghiên cứu về cấu trúc siêu nhỏ và mô hóa học. Ở ngoại vi, tế bào sụn có đường viền hình đĩa và được bao quanh bởi một ECM thưa thớt; người ta biết rất ít về các đặc điểm chức năng của các tế bào như vậy.

Có thể nuôi cấy tế bào sụn trên các vi chất mang được duy trì trong huyền phù; các hạt dextran (cytodex), các hạt dextran phủ collagen (cytodex III) và các vi cầu không xốp của collagen loại I (cellagen) được sử dụng làm vi chất mang. Trong các điều kiện nuôi cấy này, tế bào sụn bám vào bề mặt của vi chất mang, giữ nguyên hình cầu và tạo ra vật liệu giống như ma trận. Hơn nữa, việc sử dụng cellagen thúc đẩy sự tăng sinh tế bào sụn và tái biểu hiện kiểu hình bình thường. Do đó, nuôi cấy tế bào sụn trên vi cầu cellagen có thể được sử dụng để phục hồi kiểu hình tế bào trước khi cấy ghép.

Một phương pháp khác để nuôi cấy huyền phù tế bào sụn trong môi trường lỏng là nuôi cấy chúng dưới dạng các quả bóng đặc gồm các tế bào (0,5-1 * 10 ^b ), thu được bằng cách ly tâm. Các tế bào sụn như vậy có khả năng tạo ra một ma trận chứa một lượng lớn proteoglycan, collagen loại II, nhưng không phải collagen loại I, điều này được xác nhận bằng các phương pháp mô học, miễn dịch mô hóa học và định lượng.

Treo tế bào sụn trong ECM tự nhiên

Tế bào sụn có thể được nuôi cấy trong môi trường huyền phù trong một ma trận ba chiều (thạch mềm, agarose, gel hoặc bọt biển collagen, axit hyaluronic, keo fibrin, hạt alginate).

Chondrocyte nuôi cấy trong agarose vẫn giữ nguyên kiểu hình bình thường và tổng hợp collagen loại II và các chất kết tụ aggrecan đặc hiệu mô. Khi nuôi cấy trong agarose, các proteoglycan do tế bào tổng hợp được giải phóng vào môi trường trong 50 ngày. Để so sánh, trong nuôi cấy đơn lớp, pha tế bào được lấp đầy glycosaminoglycan ngay trong 5-6 ngày đầu tiên nuôi cấy; khi nuôi cấy trong môi trường, sau khi tổng hợp và giải phóng glycosaminoglycan tăng lên trong 8-10 ngày đầu tiên, chúng sẽ giảm dần theo thời gian. Tuy nhiên, hành vi của chondrocyte khi nuôi cấy trong agarose khác với in vivo. Trong agarose, một số lượng lớn các chất kết tụ aggrecan tổng hợp chứa các phân tử nhỏ hơn và ít phân tử hơn so với in vivo. TGF-β kích thích tổng hợp proteoglycan trong explants, nhưng làm giảm tổng hợp aggrecan trong agarose.

Alginate là một polysaccharide tuyến tính thu được từ rong biển nâu. Khi có mặt các cation hóa trị hai, chẳng hạn như ion Ca2 ⁺, polyme này trở thành gel. Mỗi tế bào sụn bị mắc kẹt trong alginate được bao quanh bởi một ma trận polysaccharide tích điện âm, các lỗ chân lông của chúng tương đương với các lỗ chân lông trong sụn hyaline. Ma trận được hình thành bởi các tế bào sụn trong các hạt alginate bao gồm hai ngăn - một lớp mỏng của ma trận liên kết tế bào tương ứng với ma trận quanh tế bào và lãnh thổ của sụn khớp và một ma trận xa hơn tương đương với ma trận liên lãnh thổ trong mô bản địa. Vào ngày thứ 30 của quá trình nuôi cấy, thể tích tương đối và tuyệt đối do các tế bào và mỗi ngăn trong hai ngăn trong hạt alginate chiếm giữ gần như hoàn toàn giống với thể tích trong sụn bản địa. Trong gần 30 ngày, các tế bào sụn giữ nguyên hình cầu và tạo ra aggrecan, các đặc tính thủy động của chúng tương tự như các phân tử aggrecan trong ma trận sụn khớp, cũng như các phân tử collagen loại II, IX và XI. Đồng thời, giống như các nuôi cấy huyền phù khác, các tế bào dẹt có mặt trên bề mặt của hạt alginate, tạo ra một lượng nhỏ các phân tử collagen loại I, được giải phóng trực tiếp vào môi trường và không được đưa vào ECM. Sự tăng sinh vừa phải của các tế bào sụn được quan sát thấy trong các hạt alginate. Sau 8 tháng nuôi cấy trong gel alginate, các tế bào sụn trưởng thành không mất hoạt động trao đổi chất và tiếp tục tổng hợp collagen loại II và aggrecan đặc hiệu mô.

H. Tanaka và cộng sự (1984) đã nghiên cứu các đặc tính khuếch tán của nhiều phân tử tự nhiên khác nhau trong alginate và phát hiện ra rằng các phân tử lớn hơn 70 kDa không khuếch tán qua alginate. Do đó, nuôi cấy tế bào trong alginate phù hợp để nghiên cứu quá trình điều hòa sinh tổng hợp ma trận và tổ chức ECM. Sự sẵn có của các tế bào được nuôi cấy trong alginate cho phép nghiên cứu hoạt động của các yếu tố điều hòa peptide và các tác nhân dược lý ở cấp độ phiên mã, sau phiên mã và dịch mã.

Chondrocyte cũng được nuôi cấy trong ma trận sợi collagen loại I và II. S. Nehrer và cộng sự (1997) đã so sánh chức năng của chondrocyte ở chó trong ma trận polyme collagen-proteoglycan xốp chứa collagen các loại khác nhau. Họ phát hiện ra sự khác biệt quan trọng trong hình thái chức năng sinh tổng hợp của chondrocyte được nuôi cấy trong ma trận collagen chứa collagen loại I và II. Các tế bào trong ma trận collagen loại II vẫn giữ nguyên hình cầu, trong khi ở collagen loại I, chúng có hình thái giống nguyên bào sợi. Hơn nữa, trong ma trận collagen loại II, chondrocyte sản xuất ra nhiều glycosaminoglycan hơn. J. van Susante và cộng sự (1995) đã so sánh các đặc tính của chondrocyte được nuôi cấy trong gel alginat và collagen (loại I). Các tác giả phát hiện ra sự gia tăng đáng kể về số lượng tế bào trong gel collagen, nhưng từ ngày thứ 6 nuôi cấy, các tế bào mất đi kiểu hình đặc trưng của chúng, biến thành các tế bào giống nguyên bào sợi. Trong gel alginate, số lượng tế bào giảm, nhưng tế bào sụn vẫn giữ nguyên kiểu hình bình thường. Trong gel collagen, số lượng proteoglycan trên mỗi tế bào cao hơn đáng kể so với trong alginate, nhưng trong gel, quá trình tổng hợp các thành phần ma trận giảm, bắt đầu từ ngày thứ 6 nuôi cấy, trong khi trong alginate, quá trình tổng hợp tiếp tục tăng.

Ma trận fibrin ba chiều rắn là một chất tự nhiên hỗ trợ các tế bào sụn được treo trong đó theo kiểu hình biệt hóa. Ma trận fibrin ba chiều cũng có thể được sử dụng làm chất mang trong cấy ghép tế bào sụn. Ưu điểm của fibrin là không có độc tính tế bào, khả năng lấp đầy không gian và khả năng kết dính. Các nghiên cứu về mô học và sinh hóa, chụp X-quang tự động và kính hiển vi điện tử đã chỉ ra rằng các tế bào sụn trong gel fibrin vẫn giữ nguyên hình thái, tăng sinh và tạo ra ma trận ngay cả sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, G. Homminga và cộng sự (1993) đã báo cáo rằng sự phân hủy fibrin bắt đầu sau 3 ngày nuôi cấy và quá trình biệt hóa lại tế bào sụn diễn ra.

Treo tế bào sụn trong ECM nhân tạo (tổng hợp)

Cấy ghép sụn cho phẫu thuật tái tạo hoặc chỉnh hình có thể thu được bằng cách nuôi cấy tế bào sụn riêng biệt trong ống nghiệm trong một ma trận tổng hợp tương thích sinh học.

Chondrocyte được nuôi cấy trong axit polyglycolic tăng sinh và duy trì hình thái và kiểu hình bình thường trong 8 tuần. Phức hợp chondrocyte-axit polyglycolic bao gồm các tế bào, glycosaminoglycan, collagen và có một nang collagen bên ngoài. Tuy nhiên, các cấy ghép như vậy chứa hai loại phân tử collagen - I và II. Các cấy ghép từ chondrocyte mất biệt hóa bởi một loạt các đoạn có lượng glycosaminoglycan và collagen lớn hơn so với các cấy ghép từ chondrocyte ban đầu chưa biệt hóa.

L. Freed và cộng sự (1993b) đã so sánh hành vi của nuôi cấy tế bào sụn ở người và bò trong axit polyglycolic dạng sợi (FPGA) và axit polylactic xốp (PPLA). Sau 6-8 tuần nuôi cấy tế bào sụn bò trong FPGA hoặc PPLA, các tác giả đã quan sát thấy sự tăng sinh tế bào và tái tạo ma trận sụn. Trong FPGA, tế bào sụn có hình cầu và nằm trong các khoảng trống được bao quanh bởi ma trận sụn. Sau 8 tuần nuôi cấy trong ống nghiệm, mô tái tạo chứa tới 50% vật chất khô (4% khối lượng tế bào, 15% glycosaminoglycan và 31% collagen). Trong PPLA, các tế bào có hình thoi và một lượng nhỏ glycosaminoglycan và collagen. Trong FPGA, sự tăng trưởng của tế bào mạnh gấp 2 lần so với PPLA. Trong cơ thể sống, tế bào sụn được nuôi cấy trong VPGK và PPLC tạo ra mô tương tự về mặt mô học với sụn trong vòng 1-6 tháng. Các chất cấy ghép có chứa glycosaminoglycan, collagen loại I và loại II.

Tế bào sụn bào thai bò được nuôi cấy trong polyethylene kỵ nước và ưa nước có mật độ cao xốp. Sau 7 ngày ủ trong cả hai chất nền, các tế bào vẫn giữ được hình cầu và chứa chủ yếu collagen loại II. Sau 21 ngày nuôi cấy, chất nền ưa nước được phát hiện chứa nhiều collagen loại II hơn chất nền kỵ nước.

Mô sụn cũng có thể thu được bằng cách nuôi cấy trong một lớp đơn trên các bộ lọc Millicell-CM. Việc phủ trước các bộ lọc bằng collagen là cần thiết để gắn kết chondroitin. Kiểm tra mô học của nuôi cấy cho thấy sự tích tụ của các tế bào sụn trong ECM chứa proteoglycan và collagen loại II. Collagen loại I không được phát hiện trong một nuôi cấy như vậy. Các tế bào sụn trong mô sụn thu được có hình cầu, nhưng trên bề mặt mô, chúng hơi dẹt. Độ dày của mô mới hình thành tăng theo thời gian và phụ thuộc vào mật độ ban đầu của lớp đơn tế bào. Trong điều kiện nuôi cấy tối ưu, độ dày của mô sụn đạt 110 μm, tổ chức các tế bào và collagen của nó thành các lớp nông và sâu tương tự như sụn khớp. ECM chứa nhiều collagen và proteoglycan hơn khoảng 3 lần. Sau 2 tuần nuôi cấy, sự tích tụ của ma trận đã được quan sát thấy, cho phép chiết xuất mô từ bộ lọc và sử dụng để cấy ghép.

Sims và cộng sự (1996) đã nghiên cứu việc nuôi cấy tế bào sụn trong gel polyethylene oxide, một ma trận polyme được bao bọc cho phép truyền số lượng lớn tế bào bằng cách tiêm. Sáu tuần sau khi tiêm vào mô dưới da của chuột không có tuyến ức, sụn mới được hình thành, được đặc trưng về mặt hình thái bằng màu trắng đục tương tự như sụn trong suốt. Dữ liệu mô học và sinh hóa chỉ ra sự hiện diện của tế bào sụn đang tăng sinh tích cực tạo ra ECM.

Giải thích

Cấy ghép mô sụn được sử dụng để nghiên cứu các quá trình ana- và dị hóa trong đó, duy trì cân bằng nội môi, tiêu hủy và sửa chữa. Các tế bào sụn trong các mẫu cấy sụn duy trì kiểu hình bình thường và thành phần ECM tương tự như trong sụn khớp in vivo. Sau 5 ngày nuôi cấy trong sự hiện diện của huyết thanh, đạt được mức độ tổng hợp và các quá trình phân hủy tự nhiên không đổi. Sự tiêu hủy mô có thể được đẩy nhanh trong nuôi cấy chính và trong nuôi cấy khi bổ sung huyết thanh bằng cách sử dụng một số tác nhân, chẳng hạn như IL-IB, TNF-α, lipopolysaccharides của vi khuẩn, dẫn xuất của axit retinoic hoặc các gốc oxy hoạt tính. Để nghiên cứu quá trình phục hồi sụn, tổn thương của nó được gây ra bởi các chất trung gian gây viêm hòa tan (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-α) hoặc sự vỡ vật lý của ma trận.

Phương pháp nuôi cấy mô hình cơ quan là một mô hình nghiên cứu trong ống nghiệm về tác động của các yếu tố bên ngoài bị cô lập lên tế bào sụn và ma trận xung quanh. Trong cơ thể sống, tế bào sụn nằm rải rác trong ECM và không tiếp xúc với nhau. Nuôi cấy explants sụn khớp bảo tồn tổ chức cấu trúc này, cũng như các tương tác cụ thể giữa tế bào sụn và môi trường ngoại bào xung quanh. Mô hình này cũng được sử dụng để nghiên cứu tác động của ứng suất cơ học, tác nhân dược lý, yếu tố tăng trưởng, cytokine và hormone lên quá trình chuyển hóa sụn.

Một lợi thế khác của việc cấy ghép mô sụn là không gây tổn thương cho tế bào sụn dưới tác động của các enzyme phân giải protein hoặc các yếu tố cơ học, điều này là không thể tránh khỏi khi phân lập tế bào. Các thụ thể và các protein màng khác và glycoprotein được bảo vệ khỏi các yếu tố gây tổn thương.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Văn hóa Chondron

Chondron là một đơn vị cấu trúc, chức năng và chuyển hóa của sụn khớp bao gồm một tế bào sụn, ma trận quanh tế bào và nang dạng sợi nhỏ gọn và chịu trách nhiệm cho cân bằng ma trận. Chondron được chiết xuất cơ học từ sụn và thu thập bằng nhiều lần đồng nhất hóa tốc độ thấp liên tiếp. Chondron được phân lập từ các vùng có độ sâu sụn khác nhau có thể được chia thành bốn loại: chondron đơn, chondron ghép đôi, nhiều (ba hoặc nhiều hơn) chondron sắp xếp theo đường thẳng (cột chondron) và cụm chondron.

Chondron đơn thường được tìm thấy ở các lớp giữa của sụn còn nguyên vẹn, chondron ghép đôi được tìm thấy ở ranh giới của các lớp giữa và sâu, nhiều chondron sắp xếp theo tuyến tính là điển hình của các lớp sâu của sụn còn nguyên vẹn. Cuối cùng, các cụm chondron bao gồm các nhóm chondron đơn và ghép đôi được sắp xếp ngẫu nhiên, giữ nguyên trạng thái kết tụ sau khi đồng nhất hóa. Các cụm chondron là các mảnh sụn lớn, thường chứa một số chondron và các sợi collagen được sắp xếp theo hướng xuyên tâm, tức là, một đặc điểm tổ chức điển hình của các lớp sâu của ma trận. Chondron được cố định trong agarose trong suốt, cho phép nghiên cứu cấu trúc, thành phần phân tử và hoạt động trao đổi chất của chúng. Hệ thống chondron-agarose được coi là một mô hình vi mô của sụn, khác với hệ thống chondrocyte-agarose truyền thống ở chỗ vi môi trường tự nhiên được bảo tồn và không cần tổng hợp và lắp ráp nó. Nuôi cấy chondron là một mô hình để nghiên cứu sự tương tác của tế bào và ma trận trong sụn khớp trong điều kiện bình thường và bệnh lý.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Nuôi cấy tế bào sụn bất tử

Virus chứa oncogene hoặc DNA tái tổ hợp có khả năng khiến tế bào "bất tử" được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào vĩnh viễn. Các tế bào sụn bất tử có khả năng sinh sôi vô tận trong khi vẫn duy trì kiểu hình ổn định. F. Mallein-Gerin và cộng sự (1995) đã chỉ ra rằng oncogene SV40T gây ra sự sinh sôi của các tế bào sụn chuột, tiếp tục biểu hiện ổn định các loại collagen II, IX và XI, cũng như protein liên kết và aggrecan khớp. Tuy nhiên, dòng tế bào như vậy có khả năng tổng hợp collagen loại I khi nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy đơn lớp hoặc trong gel agarose.

W. Horton và cộng sự (1988) đã mô tả một dòng tế bào bất tử có mức độ biểu hiện thấp của mRNA collagen loại II. Các tế bào này thu được bằng cách biến đổi chúng với một loại retrovirus chuột chứa gen ung thư I-myc và y-ra. Loại tế bào này đại diện cho một mô hình độc đáo để nghiên cứu các tương tác của ma trận khớp khi không có collagen loại II, cũng như điều chỉnh quá trình tổng hợp collagen loại II.

Nuôi cấy chondroprites với gen đột biến hoặc bị xóa là một mô hình thuận tiện để nghiên cứu chức năng sinh lý của chúng. Mô hình này đặc biệt phù hợp để nghiên cứu vai trò của các phân tử cụ thể trong việc tổ chức ma trận sụn hoặc để nghiên cứu tác động của các yếu tố điều hòa khác nhau lên quá trình chuyển hóa sụn. Các tế bào sụn có gen bị xóa đối với collagen loại IX tổng hợp các sợi collagen rộng hơn bình thường, cho thấy collagen loại IX điều chỉnh đường kính của các sợi. Như đã lưu ý trong Chương 1, một đột biến trong gen COLAI mã hóa collagen loại II gần đây đã được phát hiện ở các gia đình mắc bệnh thoái hóa khớp toàn thể nguyên phát. Để nghiên cứu tác động của collagen loại II đột biến lên ma trận khớp, R. Dharmrvaram và cộng sự (1997) đã chuyển gen (nhiễm axit nucleic lạ) khiếm khuyết COL ₂ AI (arginine ở vị trí 519 được thay thế bằng cysteine) vào các tế bào sụn của thai nhi người trong ống nghiệm.

Hệ thống nuôi cấy chung. Trong khớp, sụn tương tác với các loại tế bào khác có trong màng hoạt dịch, dịch hoạt dịch, dây chằng và xương dưới sụn. Quá trình chuyển hóa của tế bào sụn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố hòa tan được tổng hợp bởi các tế bào được liệt kê. Do đó, trong viêm khớp, sụn khớp bị phá hủy bởi các enzyme phân giải protein và các gốc tự do do các tế bào hoạt dịch tạo ra. Do đó, các mô hình đã được phát triển để nghiên cứu các tương tác phức tạp giữa sụn và các mô xung quanh, được gọi là nuôi cấy chung.

S. Lacombe-Gleise và cộng sự (1995) nuôi cấy tế bào sụn thỏ và tế bào tạo xương trong hệ thống nuôi cấy chung (COSTAR) trong đó các tế bào được tách biệt bằng màng vi xốp (0,4 μm) cho phép trao đổi giữa hai loại tế bào mà không có bất kỳ tiếp xúc trực tiếp nào. Nghiên cứu này chứng minh khả năng của tế bào tạo xương kích thích sự phát triển của tế bào sụn thông qua các chất trung gian hòa tan.

AM Malfait và các đồng tác giả (1994) đã nghiên cứu mối quan hệ giữa các tế bào đơn nhân máu ngoại vi và các tế bào sụn. Mô hình này thuận tiện cho việc nghiên cứu các quá trình trung gian bởi cytokine trong các bệnh lý viêm khớp (viêm khớp dạng thấp, viêm cột sống dính khớp huyết thanh âm tính, v.v.). Các tác giả của mô hình đã tách các tế bào bằng màng liên kết protein có lỗ có đường kính 0,4 μm. Nghiên cứu cho thấy các tế bào đơn nhân được kích thích bằng lipopolysaccharide sản xuất IL-1 và TNF-α, ức chế quá trình tổng hợp aggrecan của các tế bào sụn và góp phần vào quá trình phân hủy các chất kết tụ aggrecan đã được tổng hợp.

K. Tada và cộng sự (1994) đã tạo ra một mô hình đồng nuôi cấy trong đó các tế bào nội mô trong gel collagen (loại I) được đặt trong một khoang bên trong tách biệt với khoang bên ngoài với các tế bào sụn được đặt trong đó bằng một bộ lọc có kích thước lỗ 0,4 μm. Ở trạng thái cô lập hoàn toàn với khoang bên ngoài, các tế bào nội mô của con người hình thành các ống trong gel collagen khi có EGF hoặc TGF-a. Khi cả hai loại tế bào được nuôi cấy đồng thời, sự hình thành ống phụ thuộc TGF-a của các tế bào nội mô bị ức chế. Sự ức chế quá trình này của các tế bào sụn đã bị loại bỏ một phần bởi các kháng thể chống TGF-beta. Có thể cho rằng TGF-beta do các tế bào sụn sản xuất ức chế quá trình mạch máu hóa của chính sụn.

S. Groot và cộng sự (1994) đồng thời nuôi cấy tế bào sụn từ vùng phì đại và tăng sinh của xương của thai nhi chuột 16 ngày tuổi với các mảnh mô não. Sau 4 ngày nuôi cấy, quá trình biệt hóa chuyển hóa của tế bào sụn thành tế bào tạo xương và bắt đầu hình thành dạng xương đã được quan sát thấy. Sau 11 ngày nuôi cấy, một phần sụn được thay thế bằng mô xương và ma trận xương được canxi hóa một phần. Một số neuropeptide và chất dẫn truyền thần kinh do mô não sản xuất ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa của tế bào tạo xương hoặc có thụ thể cho chúng. Trong số đó có norepinephrine, peptide ruột hoạt hóa mạch, peptide liên quan đến gen calcitonin, chất P và somatostatin. Các mảnh mô não được nuôi cấy cùng với tế bào sụn có thể tạo ra một số yếu tố được liệt kê có khả năng gây ra quá trình biệt hóa chuyển hóa của tế bào sụn thành tế bào tạo xương.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến nuôi cấy tế bào sụn

Ảnh hưởng của độ căng oxy lên quá trình chuyển hóa của tế bào sụn

Trong hầu hết các trường hợp, nuôi cấy tế bào sụn phát triển trong điều kiện căng thẳng oxy trong khí quyển. Tuy nhiên, người ta biết rõ rằng tế bào sụn trong cơ thể sống tồn tại trong điều kiện thiếu oxy và căng thẳng oxy thay đổi trong các điều kiện bệnh lý khác nhau. Trong quá trình trưởng thành, người ta quan sát thấy những thay đổi đáng kể trong nguồn cung cấp máu đến các đầu xương. Vì mạch máu thay đổi ở các vùng khác nhau của đĩa tăng trưởng, nên căng thẳng oxy trong chúng cũng thay đổi. C. Brighton và R. Heppenstall (1971) đã chứng minh rằng ở đĩa xương chày của thỏ, căng thẳng oxy ở vùng phì đại thấp hơn ở sụn xung quanh. Các phép đo một số thông số chuyển hóa cho thấy tế bào sụn có thể phản ứng nhanh với những thay đổi cục bộ về nồng độ oxy. Trước hết, ở mức căng thẳng oxy thấp, mức tiêu thụ oxy của tế bào sụn giảm. Khi mức căng thẳng oxy giảm từ 21 xuống 0,04%, việc sử dụng glucose tăng lên, hoạt động của các enzyme phân giải đường và quá trình tổng hợp axit lactic tăng lên. Ngay cả ở mức căng thẳng oxy thấp, lượng ATP, ADP và AMP tuyệt đối vẫn ổn định. Những dữ liệu này chỉ ra rằng quá trình chuyển hóa của tế bào sụn hướng đến mục tiêu bảo tồn năng lượng tối đa. Tuy nhiên, hoạt động tổng hợp và do đó là quá trình sửa chữa thay đổi trong điều kiện thiếu oxy.

Độ căng oxy cao cũng ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa của tế bào sụn, gây ra sự giảm tổng hợp proteoglycan và DNA và sự thoái hóa của ma trận sụn. Những tác động này thường đi kèm với việc sản xuất các gốc oxy tự do.

Ảnh hưởng của nồng độ ion và áp suất thẩm thấu của môi trường lên chức năng của tế bào sụn

Ở sụn tự nhiên, nồng độ ion khác đáng kể so với các mô khác: hàm lượng natri trong môi trường ngoại bào là 250-350 mmol và độ thẩm thấu của nó là 350-450 mosmol. Khi tế bào sụn được phân lập từ ECM và ủ trong môi trường chuẩn (DMEM (Môi trường thiết yếu tối thiểu của Dulbecco), độ thẩm thấu là 250-280,7 mosmol), môi trường xung quanh tế bào thay đổi đáng kể. Ngoài ra, nồng độ canxi và kali trong môi trường chuẩn thấp hơn đáng kể so với mô tự nhiên và nồng độ anion cao hơn đáng kể.

Việc bổ sung sucrose vào môi trường làm tăng độ thẩm thấu của môi trường và gây ra sự gia tăng tạm thời nồng độ anion H ⁺ và canxi trong tế bào chất. Những thay đổi nội bào như vậy có thể ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào sụn và hoạt động trao đổi chất của chúng. J. Urban và cộng sự (1993) phát hiện ra rằng sự kết hợp của ³⁵ 8-sulfate và ³ H-proline bởi các tế bào sụn được phân lập ủ trong DMEM chuẩn trong 2-4 giờ chỉ bằng 10% so với mô tự nhiên. Cường độ tổng hợp đạt cực đại ở độ thẩm thấu của môi trường ngoại bào là 350-400 mosmol ở cả tế bào sụn mới phân lập và trong các mẫu mô sụn. Hơn nữa, thể tích của tế bào sụn tăng 30-40% sau khi đặt các tế bào được phân lập vào DMEM chuẩn có độ thẩm thấu được chỉ định. Tuy nhiên, khi nuôi cấy tế bào sụn trong điều kiện thẩm thấu không sinh lý trong 12-16 giờ, các tế bào sẽ thích nghi với điều kiện mới, làm giảm cường độ sinh tổng hợp theo sự thay đổi thẩm thấu của môi trường ngoại bào.

P. Borgetti và cộng sự (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ thẩm thấu môi trường ngoại bào lên sự phát triển, hình thái và sinh tổng hợp của tế bào sụn lợn. Các tác giả đã chứng minh các đặc điểm sinh hóa và hình thái tương tự của tế bào sụn được nuôi cấy trong môi trường có độ thẩm thấu là 0,28 và 0,38 mosmol. Ở độ thẩm thấu môi trường là 0,48 mosmol, sự giảm sinh sản tế bào và tổng hợp protein đã được quan sát thấy trong 4-6 giờ đầu tiên nuôi cấy, nhưng các thông số này sau đó đã phục hồi và cuối cùng đạt đến giá trị kiểm soát. Khi tế bào sụn được nuôi cấy trong môi trường có độ thẩm thấu là 0,58 mosmol, các tế bào mất khả năng duy trì cường độ sinh lý của các quá trình tăng sinh và sau 6 ngày, số lượng tế bào sụn giảm đáng kể. Ở độ thẩm thấu trung bình là 0,58 mosmol, sự ức chế sâu sắc của quá trình tổng hợp protein đã được quan sát thấy. Ngoài ra, khi nuôi cấy trong môi trường có độ thẩm thấu 0,28-0,38 mOsm, tế bào sụn vẫn giữ nguyên kiểu hình sinh lý của chúng; ở độ thẩm thấu cao hơn (0,48-0,58 mOsm), những thay đổi đáng kể về hình thái tế bào xảy ra, biểu hiện bằng việc mất kiểu hình đặc trưng, tế bào sụn chuyển thành tế bào giống nguyên bào sợi và tế bào mất khả năng lắp ráp proteoglycan ma trận. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra khả năng của tế bào sụn phản ứng với những biến động hạn chế về độ thẩm thấu của môi trường ngoại bào.

Sự thay đổi nồng độ các ion khác cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp ở tế bào sụn. Do đó, mức độ kết hợp ³⁵ S (sulfat) tăng một nửa khi nồng độ ion kali tăng từ 5 mmol (nồng độ trong môi trường DM EM tiêu chuẩn) lên 10 mmol (nồng độ trong ECM in vivo). Nồng độ canxi dưới 0,5 mmol thúc đẩy sản xuất collagen bởi tế bào sụn bò trưởng thành, trong khi nồng độ 1-2 mmol (tương ứng với nồng độ trong môi trường DM EM tiêu chuẩn) gây ra sự giảm đáng kể trong quá trình tổng hợp collagen. Sự gia tăng vừa phải trong quá trình sinh tổng hợp đã được quan sát thấy ở mức canxi cao (2-10 mmol). Nhiều cation khác nhau tham gia vào quá trình gắn kết của tế bào sụn với protein ECM. Do đó, các ion magiê và mangan cung cấp sự gắn kết với fibronectin và collagen loại II, trong khi các ion canxi không tham gia vào quá trình gắn kết của tế bào sụn với protein. Như vậy, kết quả các nghiên cứu nêu trên cho thấy ảnh hưởng của những thay đổi trong các ion ngoại bào là kali, natri, canxi và độ thẩm thấu của môi trường lên chức năng sinh tổng hợp của tế bào sụn được ủ trong môi trường chuẩn.

Tác động của ứng suất cơ học lên quá trình chuyển hóa của tế bào sụn

Bất động khớp gây teo sụn có thể hồi phục, cho thấy nhu cầu kích thích cơ học đối với các quá trình trao đổi chất bình thường trong ECM. Trong hầu hết các trường hợp, các mô hình nuôi cấy tế bào được sử dụng tồn tại dưới áp suất khí quyển bình thường. M. Wright và cộng sự (1996) đã chỉ ra rằng môi trường cơ học ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào sụn, phản ứng của tế bào phụ thuộc vào cường độ và tần suất của tải trọng nén. Các thí nghiệm với tải trọng trên explants của sụn khớp còn nguyên vẹn trong ống nghiệm đã chứng minh sự giảm tổng hợp protein và proteoglycan dưới tác động của tải trọng tĩnh, trong khi tải trọng động kích thích các quá trình này. Cơ chế chính xác của tác động của tải trọng cơ học lên sụn rất phức tạp và có thể liên quan đến biến dạng tế bào, áp suất thủy tĩnh, áp suất thẩm thấu, điện thế và thụ thể tế bào bề mặt đối với các phân tử ma trận. Để nghiên cứu tác động của từng thông số này, cần phải tạo ra một hệ thống trong đó một thông số có thể thay đổi độc lập. Ví dụ, nuôi cấy explants không phù hợp để nghiên cứu biến dạng tế bào, nhưng nó có thể được sử dụng để nghiên cứu tác động chung của áp suất lên hoạt động trao đổi chất của tế bào sụn. Sự nén của sụn dẫn đến biến dạng tế bào và cũng đi kèm với sự xuất hiện của một gradient áp suất thủy tĩnh, điện thế, dòng chảy chất lỏng và những thay đổi trong các thông số lý hóa học như hàm lượng nước trong ma trận, mật độ điện tích và mức áp suất thẩm thấu. Biến dạng tế bào có thể được nghiên cứu bằng cách sử dụng các tế bào sụn riêng biệt được ngâm trong gel agarose hoặc collagen.

Một số hệ thống đã được phát triển để nghiên cứu tác động của kích thích cơ học lên nuôi cấy tế bào sụn. Một số nhà nghiên cứu sử dụng các hệ thống trong đó áp suất được áp dụng cho nuôi cấy tế bào thông qua pha khí. Do đó, JP Veldhuijzen và cộng sự (1979), sử dụng áp suất 13 kPa trên khí quyển với tần số thấp (0,3 Hz) trong 15 phút, đã quan sát thấy sự gia tăng tổng hợp cAMP và proteoglycan và giảm tổng hợp DNA. R. Smith và cộng sự (1996) đã chỉ ra rằng việc tiếp xúc không liên tục của nuôi cấy tế bào sụn bò nguyên phát với áp suất thủy tĩnh (10 MPa) với tần số 1 Hz trong 4 giờ đã gây ra sự gia tăng tổng hợp aggrecan và collagen loại II, trong khi áp suất không đổi không ảnh hưởng đến các quá trình này. Sử dụng một hệ thống tương tự, Wright và cộng sự (1996) đã báo cáo rằng áp suất tuần hoàn lên nuôi cấy tế bào có liên quan đến quá trình phân cực quá mức của màng tế bào sụn và kích hoạt các kênh kali phụ thuộc Ca2 ⁺. Do đó, tác động của áp suất tuần hoàn được trung gian bởi các kênh ion được kích hoạt bằng lực kéo trong màng tế bào sụn. Phản ứng của tế bào sụn đối với áp suất thủy tĩnh phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy tế bào và tần suất tải trọng được áp dụng. Do đó, áp suất thủy tĩnh tuần hoàn (5 MPa) làm giảm sự kết hợp sulfat vào lớp đơn của tế bào sụn ở tần suất 0,05, 0,25 và 0,5 Hz, trong khi ở tần suất lớn hơn 0,5 Hz, sự kết hợp sulfat vào mô sụn tăng lên.

M. Bushmann và cộng sự (1992) đã báo cáo rằng các tế bào sụn trong gel agarose làm thay đổi quá trình tổng hợp sinh học để đáp ứng với tải trọng cơ học tĩnh và động theo cùng cách như cơ quan nguyên vẹn được nuôi cấy. Các tác giả phát hiện ra rằng tải trọng cơ học tạo ra kích thích tăng thẩm thấu với sự giảm pH tiếp theo ở các tế bào sụn.

Tác động của sự kéo giãn cơ học có thể được nghiên cứu trên nuôi cấy tế bào được ngâm trong gel. Lực kéo giãn có thể được tạo ra bằng cách sử dụng chân không được điều khiển bằng máy tính. Khi hệ thống ở trong một mức độ chân không nhất định, đáy đĩa Petri chứa nuôi cấy tế bào được kéo dài thêm một lượng đã biết, độ biến dạng đạt cực đại ở các cạnh của đáy đĩa và đạt cực tiểu ở giữa. Độ kéo giãn cũng được truyền đến các tế bào sụn được nuôi cấy trong đĩa Petri. Sử dụng phương pháp này, K. Holm-vall và cộng sự (1995) đã chỉ ra rằng ở các tế bào u sụn được nuôi cấy trong gel collagen (loại II), biểu hiện mRNA của 2-integrin tăng lên. _{integrin2 β} có _thể liên kết với collagen loại II. Nó được coi là một thụ thể cơ học, vì nó tương tác với các protein liên kết actin, do đó kết nối ECM và bộ xương tế bào.

Tác động của pH lên quá trình chuyển hóa của tế bào sụn

Độ pH của dịch kẽ của ECM của mô sụn có tính axit hơn so với các mô khác. A. Maroudas (1980) xác định độ pH của ma trận sụn khớp là 6,9. B. Diamant và cộng sự (1966) tìm thấy độ pH là 5,5 trong điều kiện bệnh lý. Người ta biết rằng tế bào sụn sống ở PO2 thấp, điều này chỉ ra vai trò quan trọng của quá trình đường phân (chiếm 95% tổng quá trình chuyển hóa glucose) trong quá trình chuyển hóa của các tế bào này; quá trình đường phân đi kèm với việc sản xuất một lượng lớn axit lactic.

Ngoài quá trình axit hóa môi trường do các sản phẩm đường phân, bản thân các thành phần của ma trận cũng có tầm quan trọng lớn. Lượng lớn điện tích âm cố định trên proteoglycan làm thay đổi thành phần ion ngoại bào: nồng độ cation tự do cao (ví dụ: H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) và nồng độ anion thấp (ví dụ: O2, HCO3) được quan sát thấy. Ngoài ra, dưới ảnh hưởng của tải trọng cơ học, nước bị đẩy ra khỏi ECM, dẫn đến tăng nồng độ điện tích âm cố định và thu hút nhiều cation hơn vào ma trận. Điều này đi kèm với việc giảm độ pH của môi trường ngoại bào, ảnh hưởng đến độ pH nội bào, do đó làm thay đổi quá trình trao đổi chất của tế bào sụn. R. Wilkin và A. Hall (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH của môi trường ngoại bào và nội bào đến quá trình tổng hợp sinh học ma trận của tế bào sụn bò được phân lập. Họ đã quan sát thấy sự thay đổi kép của quá trình tổng hợp ma trận với sự giảm độ pH. Giảm nhẹ pH (7,4 của 35 SO ₄ và ³ H-proline vào tế bào sụn, trong khi axit hóa sâu hơn của môi trường (pH <7,1) ức chế tổng hợp 75% so với đối chứng. Tạo ra độ pH thấp (6,65) bằng cách sử dụng các ion amoni chỉ làm giảm tổng hợp ma trận 20%. Kết quả thu được chỉ ra rằng sự thay đổi độ pH của môi trường ngoại bào trong quá trình tổng hợp ma trận không thể chỉ được giải thích bằng những thay đổi về độ pH của môi trường nội bào. Hơn nữa, tế bào sụn có khả năng điều chỉnh độ pH nội bào bằng cách sử dụng chất trao đổi Na ⁺, H ⁺, chất vận chuyển Cl ^_ -НСОС3 phụ thuộc Ka ⁺ và H ⁺ /ATPase.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến quá trình chuyển hóa của tế bào sụn

Môi trường nuôi cấy tế bào sụn phải tương ứng với các điều kiện thực nghiệm. Trong những năm gần đây, huyết thanh bê đã được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên, khi sử dụng huyết thanh, một số điểm quan trọng phải được lưu ý:

• sự phát triển ra bên ngoài của các tế bào từ ngoại vi của mô trong nuôi cấy cơ quan,
• sự thay đổi trong thành phần của huyết thanh của các loạt khác nhau,
• sự hiện diện của các thành phần chưa biết trong chúng,
• tăng nguy cơ nhiễu và hiện tượng nhiễu khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều yếu tố sinh học khác nhau đến hoạt động trao đổi chất của tế bào.

Một ví dụ về cái sau là nghiên cứu về tác động của EGF lên tế bào sụn ở chuột. EGF kích thích sự kết hợp của ³ H-thymidine và làm tăng hàm lượng DNA trong nuôi cấy. Tác động này rõ rệt hơn ở nồng độ huyết thanh thấp (<1%), nhưng ở nồng độ cao (>7,5%) thì tác động này biến mất.

Người ta đều biết rằng mức độ tổng hợp và phân hủy trong DMEM bổ sung huyết thanh bê tăng đáng kể so với điều kiện trong cơ thể sống. Sự khác biệt giữa quá trình chuyển hóa trong cơ thể sống và trong ống nghiệm có thể là do sự khác biệt giữa dịch hoạt dịch và môi trường nuôi cấy tế bào. Lee và cộng sự (1997) đã nuôi cấy tế bào sụn bò non trong agarose bằng cách sử dụng môi trường dinh dưỡng có chứa DMEM bổ sung 20% huyết thanh bê và một lượng lớn dịch hoạt dịch đồng loại bình thường. Sự hiện diện của dịch hoạt dịch trong môi trường đã gây ra sự gia tăng lượng proteoglycan, lên đến 80% tổng lượng dịch hoạt dịch. Những kết quả này chỉ ra rằng dịch hoạt dịch trong nuôi cấy gây ra mức độ chuyển hóa tương tự như trong cơ thể sống, với mức độ tổng hợp glycosaminoglycan cao và mức độ phân chia tế bào thấp.

G. Verbruggen và cộng sự (1995) đã chỉ ra rằng tổng hợp ³⁵ S-arrpeKaHa bởi tế bào sụn người được nuôi cấy trong agarose trong DMEM không có huyết thanh là 20-30% mức tổng hợp được quan sát thấy trong DMEM bổ sung 10% huyết thanh bê. Các tác giả đã xác định mức độ mà IGF-1, IGF-2, TGF-R hoặc insulin phục hồi sản xuất aggrecan trong môi trường không có huyết thanh. Các tác giả kết luận rằng 100 ng/ml insulin, IGF-1 hoặc IGF-2 đã phục hồi một phần quá trình tổng hợp aggrecan lên 39-53% mức kiểm soát. Không quan sát thấy hiện tượng hiệp đồng hoặc tích lũy nào khi kết hợp các yếu tố được liệt kê. Đồng thời, 10 ng/ml TGF-R khi có mặt 100 ng/ml insulin đã kích thích quá trình tổng hợp aggrecan lên 90% hoặc hơn mức tham chiếu. Cuối cùng, transferrin huyết thanh người, đơn lẻ hoặc kết hợp với insulin, không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp aggrecan. Khi huyết thanh bê được thay thế bằng albumin huyết thanh bò, hàm lượng các chất kết tụ aggrecan giảm đáng kể. Làm giàu môi trường nuôi cấy bằng insulin, IGF hoặc TGF-R đã phục hồi một phần khả năng sản xuất các chất kết tụ aggrecan của tế bào. Hơn nữa, IGF-1 và insulin có thể duy trì cân bằng nội môi trong nuôi cấy tế bào. Sau 40 ngày nuôi cấy trong môi trường được làm giàu bằng 10-20 ng/ml IGF-1, quá trình tổng hợp proteoglycan được duy trì ở mức tương đương hoặc thậm chí cao hơn so với môi trường chứa 20% huyết thanh bê. Các quá trình dị hóa diễn ra chậm hơn trong môi trường được làm giàu bằng IGF-1 so với môi trường được làm giàu bằng dung dịch albumin 0,1%, nhưng nhanh hơn một chút trong môi trường được làm giàu bằng 20% huyết thanh. Trong các nuôi cấy lâu dài, IGF-1 20 ng/ml duy trì trạng thái ổn định của tế bào.

D. Lee và cộng sự (1993) đã so sánh tác động của thành phần môi trường nuôi cấy (DMEM, DMEM+20% huyết thanh bê, DMEM+20 ng/ml IGF-1) lên quá trình tổng hợp DNA trong nuôi cấy explants mô sụn, nuôi cấy một lớp đơn và trong huyền phù agarose. Khi nuôi cấy trong agarose có sự hiện diện của huyết thanh, các tác giả đã quan sát thấy xu hướng các tế bào sụn tập hợp thành các cụm lớn. Các tế bào được nuôi cấy mà không có huyết thanh hoặc có IGF-1 vẫn giữ nguyên hình tròn trong agarose, được thu thập thành các nhóm nhỏ nhưng không tạo thành các tập hợp lớn. Trong một lớp đơn, quá trình tổng hợp DNA cao hơn đáng kể trong môi trường có chứa huyết thanh so với môi trường được làm giàu với IGF-1; quá trình tổng hợp DNA trong môi trường sau cao hơn đáng kể so với môi trường không được làm giàu. Không tìm thấy sự khác biệt nào về quá trình tổng hợp DNA khi các tế bào sụn được nuôi cấy trong huyền phù agarose trong môi trường không được làm giàu và trong môi trường có IGF-1. Đồng thời, nuôi cấy huyền phù tế bào sụn trong agarose ở môi trường giàu huyết thanh đi kèm với việc tăng cường kết hợp nucleotide phóng xạ ³ H-thymidine so với các môi trường khác.

Vitamin C cần thiết cho hoạt hóa các enzym tham gia vào quá trình hình thành cấu trúc xoắn ốc ổn định của các sợi collagen. Các tế bào sụn thiếu axit ascorbic tổng hợp các tiền chất collagen không xoắn ốc chưa được hydroxyl hóa, được tiết ra chậm. Việc sử dụng axit ascorbic (50 μg/ml) gây ra quá trình hydroxyl hóa các loại collagen II và IX và tiết ra chúng với số lượng bình thường. Việc bổ sung vitamin C không ảnh hưởng đến mức độ tổng hợp proteoglycan. Do đó, quá trình tiết collagen được điều chỉnh độc lập với quá trình tiết proteoglycan.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]